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(無題) 削除/引用 No.10242-3 - 2022/02/12 (土) 09:52:14 - あやたか おお　様 ご返信いただきありがとうごさいます。 たしかに言われてみれば、SDS-PAGEでタグが検出できなくなるなんてことはないですよね・・・ご指摘ありがとうございます。 とりあえず、SDSや尿素を十分希釈した上でIPにおいて複合体がとれてくるか、実験してみようと思います。

(無題) 削除/引用 No.10242-2 - 2022/02/10 (木) 02:47:53 - おお Cells were hot-lysed in 100 μl of denaturing buffer (1% SDS, 50 mM Tris, pH 7.5, 0.5 mM EDTA) by boiling for five minutes at 100°C. Lysates were then diluted 1:10 with NP-40 lysis buffer and subjected to immunoprecipitation using anti-Flag M2 affinity gel (Sigma) https://journals.biologists.com/Toolbox/DownloadCombinedArticleAndSupplmentPdf?resourceId=46713&multimediaId=1320832&pdfUrl=%2Fcob%2Fcontent_public%2Fjournal%2Fdev%2F141%2F7%2F10.1242_dev.099564%2F3%2F1473.pdf ていうか、SDSPAGE のときは変性させて、変性状態をなるべく維持しながら電気泳動して、それをNCとかPVDFに移してWBをやるわけで、変性させたあとも認識できる事は明らかと思いますが。

変性タンパク質の3xFLAGによるIPについて 削除/引用 No.10242-1 - 2022/02/10 (木) 00:45:27 - あやたか 3xFLAGが結合したDNA結合タンパク質を標的にChIPを行い、DNA結合タンパク質に結合しているタンパク質をLC-MS/MSにより解析しようと考えています。 MS解析に用いることを考え、解析でとれてくるタンパク質の特異性をあげるためクロマチンをまず濃縮したいと考えているのですが、その際にSDSや8M尿素による変性が必要になるようです。 3xFLAG等のペプチドタグが変性によって、抗体に認識されなくなるのではないかと危惧しているのですが、尿素やSDSによる変性後にIPを行うことはできるのでしょうか。もし、同様の実験をご経験の方がいれば、ご教授いただきたいです。 よろしくお願いいたします。

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