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(無題) 削除/引用 No.10234-4 - 2022/02/09 (水) 09:38:40 - monmon 結果的にアクセプター：ドナーの比とFRET効率でプロットすると、直線的な相関関係があり、バラツキが小さくなりました。 撮影条件を低めの発現量に固定し、ドナーもアクセプターも過剰に発現している細胞を除外しているので、意外と飽和していないのかもしれません。 ということは、ドナーとアクセプターの比でノーマライズすれば良いような気がしてきました。 あるいは、ドナーに対してアクセプターが飽和する条件の細胞を選べばFRET効率のばらつきは小さくなる、ということかも。 どちらにしても、注意すべき点が明らかになったので、少しスッキリしました。ご助言ありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.10234-3 - 2022/02/09 (水) 00:43:55 - monmon totoさん 回答ありがとうございます。 おっしゃる通り、FRET効率はアクセプターの量に比例するはず、と理解していたので、なぜアクセプターの量でノーマライズしないのかが解りませんでした。「ほとんどの場合は飽和している」という考えが浮かばず、大変助かりました。イメージングセンターの技官さんにも質問してみたのですが、納得のいく回答を得られず、悶々としておりました。 とりあえずFRET効率とアクセプターのシグナルをプロットして確かめてみます。 今のところ、撮影できるギリギリの低発現細胞を選び、撮影条件を一定にし、アクセプターフォトブリーチングは十分かつドナーをブリーチしない設定に固定して条件検討をしています。 確かに思ったよりデータのバラツキが大きく、サンプル量を増やすとなるとマニュアルで解析するのも大変で、、、信頼できて、なおかつリーズナブルな労力で実行可能な実験パイプラインを確立するのに四苦八苦しています。 今はROIの平均値でFRET効率を計算しているのですが、ピクセル毎に解析したい場合にどうすればいいのか、まだやり方が解りません。でも、解像度が高くなければ、ピクセル毎に解析する意味がないような気もしています。

(無題) 削除/引用 No.10234-2 - 2022/02/08 (火) 18:40:18 - toto アクセプターが少ないとFRET効率が下がるはず、ということですよね。たしかにそうなのですが、普通は十分にアクセプターが発現してる細胞を選ぶので、FRET効率は飽和しているはずです。細胞ごとのアクセプター量とFRET効率をプロットすると、大体、飽和曲線になります。それが大体のFRET効率になります。もちろん、極端なレベルのアクセプターやドナーの発現はおかしな値になるので、その辺の見極めが必要にはなりますが。 とはいっても、実際、FRETは難しくて、なかなかきれいにデータが揃わないこともよくあります。アクセプターブリーチの条件を適切に設定するのがコツでしょうか。 こういう計測で数がそれほどでもない場合にはImageJでマニュアルにやるほうがアルゴリズムを使うよりも簡単で正確な感じです。

FRET解析 削除/引用 No.10234-1 - 2022/02/07 (月) 14:27:21 - monmon FRETの画像解析を始めたばかりの初心者です。 分子間FRET、一過性発現の系です。 アクセプターのフォトブリーチング後にドナーのシグナルが増加するので、FRETは検出できていると思います。 私がよく解らないのは、異なるサンプル間でのノーマライズの方法です。 一過性発現ですので、ドナーとアクセプターの発現量は細胞ごとにバラバラです。 一般的なFRET効率の計算式(アクセプターフォトブリーチングの場合)は、ブリーチ前後のドナーシグナルの差/ブリーチ後のドナーシグナル*100で計算しているようです。でも、これだとアクセプターの発現量によって効率が変わってしまうと思うのです。なので、アクセプターのシグナルで割ってノーマライズするべき？でも、そのような計算式を見かけないので、何か私は勘違いしているのでしょうか？ また、FRETの検出方法、画像解析は、皆さんどのようにしていますか？ 顕微鏡付属のソフト、ImageJのプラグインや自作マクロ、画像解析専門ソフト(有料)、CellProfilerとか？ImageJのプラグインの中には古くて開発が止まっているものも多く、どれが良いのやら。 自分でマクロを組んだり、プログラムを書くようなレベルではない初心者はどこから始めたら良いのやら途方に暮れています。どなたか質の良い画像解析のプロトコルをご存知でしたら教えていただけないでしょうか。 当方、ZeissのLSM880を使用しています。Acceptor photobleaching, sensitized emission, spectrum FRET, どれも画像の取得は可能です。

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