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(無題) 削除/引用 No.10226-14 - 2022/02/08 (火) 03:38:59 - おお すんません、ちょっと書き直そうとして一度コメント削除したのですが、削除する前のテンプレコピーがミスで取れませんでした、、、

(無題) 削除/引用 No.10226-13 - 2022/02/07 (月) 12:14:47 - drop おお様 コメントに気が付かずお返事が遅くなってしまいました。 申し訳ございません。 培地中のグルコースや塩が影響するのではと考え念入りにPBS洗浄を行っておりましたが、洗浄をしない方もおられるのですね。参考になります。 TRIzol試薬の持ち込みとすると、サンプルごとのブレは私の手技の問題ですね。 正確なデータを残せるよう精進いたします、

(無題) 削除/引用 No.10226-11 - 2022/02/04 (金) 21:57:36 - drop 皆様、本日の業務にて抽出したRNAに対しエタノール沈殿を行い、また念入りに70％エタノールで洗浄を行ったところ、240nmのピークが消えはしませんでしたが小さくなり、260nmのピークが見やすくなりました。 260/230は0.5のものがまだありますが、全体的には改善しました。 少なくとも、240nmのピークが大きすぎて260nmのピークが埋もれるような事態は解消されました。 誠にありがとうございました。 >杏里様 240nmのピークがとても大きかったので、大量のコンタミが発生し核酸濃度が正しく測れていないのではないかと思って質問させていただいた次第です。 >おお様 数多くの文献をくださいまして誠にありがとうございます。ひとつひとつ拝読させていただいております。 多糖のコンタミで260/230が下がるらしいとのことですが、細胞が抱えていたのか培地成分を持ち込んだか、見当がつきかねます… 実験はエタ沈すれば良いのですが、それはそれとしてどこから入り込んだ夾雑物なのか気になる所です。 >はて？様 コメントいただきありがとうございます。 今後qPCRに掛けるため、少し用心深くなっていた所ではありました。 おお様のご指摘にある「溶媒の吸光シフト」はちょっと怖いと思ったので、これから勉強させていただきます。 >ももた様 ご指摘ありがとうございます。 クロロホルム後の水層に対しイソプロパノールを加えて5回転倒混和と3回ほど軽くタッピングしています。 転倒混和で十分かもしれませんが、混ざっているか不安になってついタッピングしてしまいます。

(無題) 削除/引用 No.10226-10 - 2022/02/04 (金) 13:11:43 - drop 皆様、ご意見いただきまして誠にありがとうございます。 お返事が遅くなってしまい申し訳ございません。 午後の業務にてエタ沈を試みますので、皆様方へのお返事、お礼と結果報告はその後にさせていただきたく存じます。 何卒よろしくお願いいたします。

(無題) 削除/引用 No.10226-9 - 2022/02/04 (金) 10:23:16 - ももた 途中でイソプロやエタノールを使っていますか？ 遠心分離をされると思いますが、上記試薬を混ぜた後には十分に転倒混和をしてください。

(無題) 削除/引用 No.10226-8 - 2022/02/04 (金) 10:10:39 - おお >[Re:6] はて？さんは書きました : > >そもそも、なんで230nmの吸収を気にする必要があるのか不思議です。 > Ratio OD260/OD230が純度の目安の一つになっているからですが、何か？ > > >>230nmより短い波長では吸光がほぼ見られません。 > >いやいや、水でも吸収あるだろ。 > > そもそも吸光度の測定の原理をわかっていらっしゃらない？ > 溶媒（例えば水）の吸光をブランクにとって溶質の吸光を測定しているわけだけど。 まあそうなんですけど、溶媒の吸収が強すぎたり、溶解したものなどで溶媒の吸収がシフト（変動）したりと言うのもあるので、リファレンスがあればいつもOKというわけではないです。ただ核酸を測るときの水なら２３０nmは長波長側ベースラインから若干立ち上がりかけているところですし、よほど微妙な測定でない限りリファレンスで対応できると思われます。

(無題) 削除/引用 No.10226-6 - 2022/02/04 (金) 09:29:46 - はて？ >そもそも、なんで230nmの吸収を気にする必要があるのか不思議です。 Ratio OD260/OD230が純度の目安の一つになっているからですが、何か？ >>230nmより短い波長では吸光がほぼ見られません。 >いやいや、水でも吸収あるだろ。 そもそも吸光度の測定の原理をわかっていらっしゃらない？ 溶媒（例えば水）の吸光をブランクにとって溶質の吸光を測定しているわけだけど。

(無題) 削除/引用 No.10226-5 - 2022/02/04 (金) 03:09:58 - おお >[Re:4] 杏里さんは書きました : > そもそも、なんで230nmの吸収を気にする必要があるのか不思議です。 > > >230nmより短い波長では吸光がほぼ見られません。 > いやいや、水でも吸収あるだろ。 > > www.jasco.co.jp/jpn/technique/internet-seminar/uv/uv5.html > これの図５参照。 Fig. 3. UV optical absorption spectra of (a) pure distilled water and /www.researchgate.net/publication/259295786_Processing_and_immobilization_of_chondroitin-4-sulphate_by_UV_laser_radiation/figures?lo=1 水の吸収は多少はあるだろうけど、この程度ならリファレンス引いているのでそんなに大きな影響を受けないはずですが、、、 お示しのリンクはNaOHによるものではないですか？ まあEDTAや炭水化物（グリコーゲンとか）でも２３０以下で吸収が強くなってくるらしいので２３０の値をあまり気にしすぎるのもどうかと。 ただ、肝臓などグリコーゲンの多い組織などではどうすべきかなどは普段そういうのを扱っているヒトにコメントもらえるといいかなと思います。 最近は各社の解説が充実してきているのでそういうのも参考にしてみてください。 /prd-sccd01-international.neb.com/-/media/nebus/files/application-notes/technote_mvs_analysis_of_nucleic_acid_concentration_and_purity.pdf?rev=c24cea043416420d84fb6bf7b554dbbb /www.vhir.org/portal1/images/content/Quality%20assessment%20of%20total%20RNA.pdf /bio.davidson.edu/GCAT/protocols/NanoDrop_tip.pdf

(無題) 削除/引用 No.10226-4 - 2022/02/03 (木) 22:35:52 - 杏里 そもそも、なんで230nmの吸収を気にする必要があるのか不思議です。 >230nmより短い波長では吸光がほぼ見られません。 いやいや、水でも吸収あるだろ。 www.jasco.co.jp/jpn/technique/internet-seminar/uv/uv5.html これの図５参照。

(無題) 削除/引用 No.10226-3 - 2022/02/03 (木) 22:28:24 - drop おお様 ご返信いただきありがとうございます。夜分遅くに申し訳ございませんでした。 抽出したRNAは冷凍保存してあるので、明日エタ沈を試みます。 添付いただいた文書を拝見いたしました。260/230は260/280より高いことが多い、と…今までそこまで見てはいませんでした。 エタ沈後はその辺りも注意して観察し、結果が出たら改めて報告に上がります。

(無題) 削除/引用 No.10226-2 - 2022/02/03 (木) 20:22:20 - おお Trizol中のPhenol Guanidinium isocyanateなどが残っている可能性があると思います。もう一度エタ沈して溶かし直すだけでも改善することがおおいです。気になるなら、間にクロロフォルムをかましてもいいでしょう。 https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/CAD/Product-Bulletins/TN52646-E-0215M-NucleicAcid.pdf

細胞から抽出したRNAの純度が悪い 削除/引用 No.10226-1 - 2022/02/03 (木) 20:05:31 - drop いつも勉強させていただいております。 最近、動物細胞を用いて遺伝子発現を調べる実験を始めました。 RNAを抽出し、逆転写してqPCRに掛けたいのですが、RNAの純度が悪く、困っております。 24穴プレートに播いた接着細胞をTRIzol試薬で溶かし、-80℃で一晩凍結してからRNA抽出作業を行っています。 nanodropでこのRNAを測定すると、どのサンプルでも260/280が1.8〜2.1の値を取ります。 ところが、260/230はサンプルによって安定せず、1.8ほどだったり0.2ほどだったりします。 波形を見ると、240nmに大きなピークがあり、サンプルによって大きさがまちまちです。240nmのピークに釣られて230nmの吸光度が上がっているように見えます（230nmにショルダーピークが無いため）。 230nmより短い波長では吸光がほぼ見られません。 260nmのピークは、240nmのピークのショルダーピークとして見えます。サンプルによっては240nmのピークに埋もれかかっていることがあり、こうなると算出された濃度が怪しく思えます。 この240nmの大きなピークが何なのか、なにかの夾雑物なのでしょうが、見当がつかず困っております。 気になる操作としては、遠心後に上層を取る時は、下層や他のものを吸わないように1/3程度残しています。 TRIzol試薬を加える前に細胞をPBSで3回リンスし、培地成分の持ち込みを減らしています。 お知恵をお貸しいただけないでしょうか。よろしくお願いいたします。

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