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(無題) 削除/引用 No.10222-6 - 2022/02/02 (水) 18:17:38 - Tg G25様 引き続き、ありがとうございます。 PCRのかかりにくいの可能性に関してはあり得るけれど、まず起こらない、という程度に関する感覚をお聞きできて、安心しました。 transgenicマウスの作出は私は関わってはおらず、担当者との引き継ぎミスによりPCRを私がやり直しているところなんです。 担当者から引き継いだPCRプロトコルでは実はB6でもバンドが出てしまうことに気づき（水では出ません）、そこで私自らPCRプロトコルの樹立をしたという背景があります。その際に使ったゲノムは複数雨のマウスのゲノムをミックスしたもので、ポジコンになると期待しています。 ただ私が樹立したプロトコルはグローバルに適用可能なのかに自信がなくなってしまい、ここで質問させていただきました。 お聞きしてよかったです。 ありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.10222-5 - 2022/02/02 (水) 14:40:15 - G25 >transgeneの有無のみです。 >タグと遺伝子を跨ぐよう設計していますので、transgeneのみ検出可能です。 だったら、「transgeneのゲノムに入る場所によっては、PCRがかかりにくい」ということはまず起こらないだろうし、仮にそういうことがあって偽陰性になったlineがあってもハズレ判定で捨てていいんじゃないの？ アタリを取り尽くす必要はなくて、良いラインが最低1 line, 多くても3 lineとか5 lineとか選べれば良いんでしょう？

(無題) 削除/引用 No.10222-4 - 2022/02/02 (水) 13:57:38 - Tg AA様 早速ありがとうございます。 可能性があると聞けて、やはりそうなのか…と思った次第です。 ただその後の文章のフォローアップで安心いたしました。 G25様 ありがとうございます。 transgeneの有無のみです。 タグと遺伝子を跨ぐよう設計していますので、transgeneのみ検出可能です。

(無題) 削除/引用 No.10222-3 - 2022/02/02 (水) 13:26:28 - G25 genotypingっていいますけれど、どこまでtypingするんでしょうね。 transgeneの有無だけ？ copy数？ integration siteの同定？ >ransgeneのゲノムに入る場所によっては、PCRがかかりにくいlineもあるのではないか と危惧する理由は？　そういうPCRのデザインだから？

(無題) 削除/引用 No.10222-2 - 2022/02/02 (水) 13:13:22 - AA lineごとにPCRのかかりやすさが異なっていて見落としているfounderがいる、と言う可能性はあると思います。 ただし、それを漏れなくPCRで拾うのは不可能です。(真に陰性の場合と偽陰性をPCRだけでは区別できない) 気になるのであればタグの免疫染色などPCRではない方法でも確認してみてPCRの結果とパラレルなら陰性と断定する、といったところでしょうか。 しかし50ライン全部について後代を確保し解析するのは大変な作業だと思いますし、そもそもスクリーニング作業というのは偽陰性と偽陽性について許容できる範囲を想定して実施するものです。 最終的に数ラインくらいしか残さないでしょうし、PCRで十分な数の陽性ラインが得られるならそれでいいのではないかと思います。

Tgマウスのgenotyping PCRについて 削除/引用 No.10222-1 - 2022/02/02 (水) 11:23:54 - Tg Tgマウスのgenotyping PCRについて質問させてください。 50ほどのTg受精卵を作製してもらい、仮親に着床させ、pupsを産ませました。 transgene（tagと遺伝子の融合遺伝子）が入っているかどうかのPCRを漸く確立できましたが、一つ疑問があります。 今のPCRプロトコルは理論的には50のindependentなlineのtransgenicマウスのgenotypingに適用できるとは思うのですが、transgeneのゲノムに入る場所によっては、PCRがかかりにくいlineもあるのではないかと不安になってきました。 質問は、樹立されたたった一つのPCRプロトコルで50のline全てのgenotypingを決定してもよいでしょうか？ 稚拙な内容で恐縮ですが、よろしくお願いします。

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