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(無題) 削除/引用 No.10206-14 - 2022/02/02 (水) 15:47:04 - Keigo qqさん この因子はΔCtの差(ΔΔCt)をStudent testをしたところ、有意な差はありませんでした。 他の因子では、有意に低下した因子がありました。 全体的にはどれもサンプル添加した場合、低下傾向の結果になりました。 sさん、おおさん 3回測定したところ、ΔCtの差(ΔΔCt)が似たような結果になりました。

(無題) 削除/引用 No.10206-13 - 2022/01/30 (日) 10:38:04 - おお 数字だけ見ると問題なさそうに見えますね。これくらいの差で18sの変動において生物学的な意味をいうのは難しいと思います。

(無題) 削除/引用 No.10206-12 - 2022/01/30 (日) 10:01:58 - qq Keigoさんの出された数値だと、サンプルの添加(有・無)で有意差はないんじゃないでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.10206-11 - 2022/01/29 (土) 19:01:37 - s 全然問題なく見えるので、定法にしたがってΔCtの差(ΔΔCt)が有意かどうか議論すればいいだけでは。 なお、「標的mRNAのΔCt」と書いておられますが、これはCtですよね。

(無題) 削除/引用 No.10206-10 - 2022/01/29 (土) 18:16:09 - Keigo あおさん キットを用いて抽出をしていたので、恥ずかしながらそのようなことは全く考えていなかったです。 sさん 18sのCt値は、19.05214691、20.30774498、20.00662613、19.08619118、19.4236927、19.05434227(サンプル無群) 18.57778168、19.0918045、19.69687843、18.14156342、18.45212173、19.30457115(サンプル有群) 標的mRNAのΔCtは、26.40119362、26.61549377、26.91406631、26.32905579 、26.33279037、26.17455292(サンプル無群) 25.99721909、26.45209503、26.14399147、26.08605003、26.11661911、26.09167671(サンプル有群) になります。

(無題) 削除/引用 No.10206-9 - 2022/01/29 (土) 09:29:38 - s G25さんにも聞かれてますが、18sのCt値がどれだけ下がっていて、標的mRNAとのΔCtがどれだけ下がっているかわからないと回答のしようがないと思います。 βアクチンが下がったという話は絶対値ですよね。2%の差ってCt値にすると0.03ぐらいのはずですが、qPCRにそんな精度ないのでは。絶対値ならなおのこと。

(無題) 削除/引用 No.10206-8 - 2022/01/29 (土) 05:55:49 - おお ＞RNAが分解されている可能性は、RNAを抽出する工程の時でしょうkか。 まあ大抵はそうです。昔は電気泳動してリボソームの２８sと１８sのシグナルが２：１くらいになっているか確認するのがスタンダードのプロトコールでした。きっちりやっていてもたまに分解して２８sのシグナルが弱くなっていたりします。RNAの分解を最初から確認しないで実験している人が、どのようにうまく抽出するコツをつかめるのかと思うことがあります。 また、細胞に薬剤なのでストレスを与えた場合、瀕死の細胞がどの程度あってその細胞のRNAは結構ダメージを受けていると言った可能性もあるかと思います。 ＞RNAの濃度は RNAの分解の可能性を聞くとこの手の答えがまあまあ帰ってきます。濃度とか２６０と２８０のレシオとか、、、例えば１０kbのRNAが１ug/ulあってそれが分解されて１０分割されて１kbになったとしても、RNAの濃度は１ug/ulですよ。もちろんかなり分解が進むと収量も低くなりますが、そういうのは相当ひどい場合です。

(無題) 削除/引用 No.10206-7 - 2022/01/28 (金) 16:55:06 - Keigo sさん 絶対値の差ではないです。 18sのCt値と測定したいmRNAのCt値を引いた後、割合で計算しています。 おおさん RNAが分解されている可能性は、RNAを抽出する工程の時でしょうkか。 RNAの濃度は50倍希釈で、200(ng/µl)前後でした。

(無題) 削除/引用 No.10206-6 - 2022/01/27 (木) 08:13:38 - おお 差が2％程というなら実験誤差に埋もれてわからないくらいの差と行ってもいいくらいだけど。 薬剤処理など細胞の状態が変わることによって、いろいろな影響が出る可能性（RTの効率だとか、RNA量測定に影響するようなものとか）があるだろうということでInternal controlを取っているわけなので、全体的にいくらか下がるならもしかしたらそういうことかもしれないとも思ったりもします。 その前に、RNAは分解されてませんか？

(無題) 削除/引用 No.10206-5 - 2022/01/26 (水) 18:09:43 - s Ct値の絶対値を比較しようとしているのでしょうか。あまり見たことないですが。2%の差というのも絶対値の差?

(無題) 削除/引用 No.10206-4 - 2022/01/26 (水) 17:23:59 - Keigo G25さん 先々、恥をかかないように正しておくが、 インナーコントロールでなくインターナルコントロール　 internal controlである。 ご指摘ありがとうございます。 勉強不足でした。語句を間違いないようします。 計測したどのmRNA種も減少していて、インターナルコントロールの18Sも減少していたとして、インターナルコントロールでnormalizeした結果はどうなんだろう？ これは、測定したmRNA ct値-18s ct値の場合でしょうか。

(無題) 削除/引用 No.10206-3 - 2022/01/26 (水) 14:23:11 - G25 計測したどのmRNA種も減少していて、インターナルコントロールの18Sも減少していたとして、インターナルコントロールでnormalizeした結果はどうなんだろう？

(無題) 削除/引用 No.10206-2 - 2022/01/26 (水) 14:10:42 - G25 先々、恥をかかないように正しておくが、 インナーコントロールでなくインターナルコントロール　 internal controlである。

mRNA測定のインナーコントロール 削除/引用 No.10206-1 - 2022/01/26 (水) 13:05:05 - Keigo いつもご教授ありがとうございます。 mRNA測定のインナーコントロールについてお聞きしたいです。 現在、インナーコントロールに18sを用いています。 今回、サンプルを添加(有・無)でRNAを回収し、mRNAを測定したところサンプル有がサンプル無と比較してどれも有意に低下を示す結果になりました。 全て低下する結果に違和感を感じ、再測定を考えています。 また、インナーコントロールに18sを用いていますが、18sのCt値(サンプル有・サンプル無)を確認したところ、有意に低下を示す結果になりました。 このことから、インナーコントロールに問題があったのではないかと思っております。 先輩のデータを確認したところ、先輩のインナーコントロールに使用していたβ-アクチンも有意に差がある結果となっていましたが、差が2％程で問題はないと言っていました。ただ本当に問題がないのか疑問で、相談しました。 インナーコントロールについて詳しい方、宜しくお願いします。

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