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(無題) 削除/引用 No.10198-4 - 2022/01/25 (火) 06:54:02 - おお 一言で言えばノンスペです。ある程度配列があっていたらそこから伸長する可能性があるので、いろいろな反応が起こる可能性が潜在的にあります。 対処方法はプライマーを変えるか、場合によっては反応条件を厳しくするかです。 後者では、アニーリング温度を上げる、伸長反応時間を短くして長いプロダクトができにくくする、タッチダウンなどで特異的な反応を優先させる、DMSO、ベタイン、グリセロールなどを加えて非特異なアニーリングを抑制するなどです。 また、スプライシングのアイソフォームが増幅されてないか確認したほうがいいのかもしれません。 ＞プライマーは各酵素のエキソンをまたぐように設計しているため、かなり長いイントロンがもし入っていても、大きすぎて検出されないようにはしています。 なんかよくわからない書き方ですが、要するに長いイントロンがあることを設計のときに確認しているということですよね。短いIntronも存在しますので。

(無題) 削除/引用 No.10198-3 - 2022/01/24 (月) 23:51:09 - ｑ ”プライマーダイマーのバンド”とはtemplateのcDNAを加えてなくても生じるバンド（サイズは？）のことでしょうか。 それともtemplate存在下で、プライマーがforward, reverseいずれか片方のみでも生じるバンド？ いずれにしても、まずプライマーの設計から見直す必要があるかと思います。

(無題) 削除/引用 No.10198-2 - 2022/01/24 (月) 17:31:56 - G25 そういうの「上流」とは言わないなあ。 不正なバンドのサイズが文字化けして読み取れないのだけれど、、、、 可能性の一つは、PCR産物の重合産物ができている。 PCRを過剰にかけると、鋳型にプライマーがアニールして伸長するんじゃなくて、鋳型同士が衝突して伸長が起こりやすくなる。結果、PCR産物の重合体、キメラができて、これが鋳型になってPCRがかかると、本来より長い産物が出現する。

非特異のバンド、濃いプライマーダイマー 削除/引用 No.10198-1 - 2022/01/24 (月) 16:51:48 - ぽん ラットの色々な組織(下垂体や十二指腸など)でのある5種類の酵素の発現をみるために、その酵素のcDNA配列からプライマーを設計し、PCRを行いました。 すると、ある酵素では目的の位置(約400bp)にバンドが出たのですが、それよりも上流(700〜800bpあたり)に複数非特異バンドがみられました。 このような非特異のバンドが現れる原因は何でしょうか？ プライマーは各酵素のエキソンをまたぐように設計しているため、かなり長いイントロンがもし入っていても、大きすぎて検出されないようにはしています。 使用したtemplateはRNA抽出を行い、RT処理をしたラット各組織のcDNAです。 また、templateとして使用していたサンプルの状態が悪かったために目的のバンドが薄くなってしまっていた組織において、再度サンプルを変えてPCRを行ったところ、よりはっきりとしたバンドが見られるだろうという予想に反して、目的のバンドの濃さは変わらないものの、プライマーダイマーが前回よりも濃くなってしまうという結果になりました。 この原因もよく分かりません。 研究室に配属されたばかりの初心者ですが、 なにか回答を頂けると幸いです。 よろしくお願いします。

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