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(無題) 削除/引用 No.10167-11 - 2022/01/12 (水) 11:52:03 - h ごめんなさい！　何か変だとおもったら組成（というよりも容量）間違ってました！ １のバッファーはtotal 2mLで記載しましたが、各サンプルにはこれを400uL入れます。つまり5サンプル分です。 ２は各サンプルあたりの容量です。 つまりTX-100はfinal 約1%でした。dose upは意味ないですね。 TCA沈殿やキットを使ってみることにしますが、手元に薬品等なく時間がかかりそうです。 また、次回からはRIPA bufferを使用することにします。 大方脂質でよいというご意見のため、方針を決定したということで一旦解決とさせていただきます。 皆様、貴重なご意見ありがとうございます。

(無題) 削除/引用 No.10167-10 - 2022/01/12 (水) 11:27:24 - h ああ、すいません。語弊がありましたが、今回のケースは脂肪肝モデルじゃない肝臓癌モデルですので脂肪量としてはそこまで多くはないです。 脂肪肝モデルの場合は脂質層をなるべく取らないようにしています。 > TX-100は考えがあって0.25%になっているのでしょうか。 先にも書きましたが、これは上司から言われた組成でして、その上司は大腸をメインにやっているので脂肪肝だから、ではないです。 > 遠心後のチューブをシリンジで上の脂質を取らないように〜 total 400uL弱で、層状ではなく上から1/3ほどに糸くずのように浮遊しているのでかなり困難です。まあ半分以上ロスすればできなくはないでしょうが・・・ フロートアップは、なるほどですね。その後の実験（IBやIP）に影響なさそうですし、少量で試してみます。 > 脂肪はタンパク定量に影響がなくとも、量が多いとSample-bufferに影響があるかも 脂質もバンドのゆがみの原因にはなるようですね。無知ですいませんでした。 逆に言えば層を作る程でなければ無視してもいいのかもしれませんね。 > １０万g以上の超遠心１-２時間回せば 脂質はそれで分離しますでしょうか。今回の件には合致しないような気がします。 正直なところ、IBやIPに影響を及ぼさなければ無視してもいいとは思っています。

(無題) 削除/引用 No.10167-9 - 2022/01/12 (水) 10:03:02 - h 皆様ありがとうございます。 > lysis bufferに段階的に試薬を添加していくのはなぜでしょうか。 ビーズショック時に過剰に泡立たないようにする、と上司より聞きました。 ホモジネートと溶解を別段階にしているだけかと。 > 抽出されるのは細胞質の易可溶性のタンパク質が主体 確かにそうですね。一応細胞質メインに存在するタンパクの実験ではありますが、上司から言われた物をそのまま使っていてあまり考えていませんでした。 組織以外はRIPA使っているので、次からRIPAに変えてみます。 > 脂質除去用キットが数社からでているようです。 基本的な質問で申し訳ありませんが、そもそもこの浮遊物は本当に脂質でよいのでしょうか？ 脂質で良ければ使用も検討ですね。 変性はちょっと避けたいところですので、一先ずライセートのTX-100の濃度あげてみます。

(無題) 削除/引用 No.10167-8 - 2022/01/12 (水) 09:57:54 - み 白い物というのが何を指しているのかわからないけど１０万g以上の超遠心１-２時間回せば上清のクリアな度合いは全然違ってくる。 小型遠心機の15000rpmなんてたかだか２万数千gだからマイクロソーム画分も除去されていないので濁っていてあたりまえ。 SDSやデオキシコール酸を含むようないわゆるRIPA bufferでも溶解されずに懸濁するのでTx100濃度を上げたところで解決しないと思う。

(無題) 削除/引用 No.10167-7 - 2022/01/12 (水) 09:56:01 - qq CDAHFDって、コリン欠乏高脂肪食なのだね。脂肪肝ですね。 それじゃTX-100は考えがあって0.25%になっているのでしょうか。 現状の条件で得られた遠心後のチューブをシリンジで上の脂質を取らないように1ml程度回収することは難しくないのではないか？ うまく回収できないのであれば、抽出液の比重をスクロースかなにかで0.3M程度に高めて、得られた抽出液に水を重層して再度遠心（30分くらい、もしくは超遠心）すると、脂質がフロートアップするんじゃなかろうか？ と、思います。

(無題) 削除/引用 No.10167-6 - 2022/01/12 (水) 05:09:48 - おお >TX-100を0.5-1.0%（final）に増やして構わなければ、脂肪が溶解すると思います。 意外とそれでも溶けなかったケースも経験したことがあったような、、、

(無題) 削除/引用 No.10167-5 - 2022/01/12 (水) 05:08:30 - おお https://www.biotechsupportgroup.com/Cleanascite-Lipid-Removal-Reagent-p/x2555.htm https://www.agilent.com/en/products/sample-preparation/sample-preparation-methods/quechers/enhanced-matrix-removal-lipid 脂質除去用キットが数社からでているようです。 変性してかまわないようならアセトンなどでタンパク質を沈殿させて、適切なバッファーで再溶解する手もあると思いますが。

(無題) 削除/引用 No.10167-4 - 2022/01/11 (火) 23:36:37 - qq TX-100を0.5-1.0%（final）に増やして構わなければ、脂肪が溶解すると思います。 脂肪はタンパク定量に影響がなくとも、量が多いとSample-bufferに影響があるかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.10167-3 - 2022/01/11 (火) 22:16:02 - bんjk Lysis bufferの組成だと、抽出されるのは細胞質の易可溶性のタンパク質が主体で、核タンパク質はあまり抽出できないように思うのですが、細胞質のタンパク質が見れれば良いという実験でしょうか。。 lysis bufferに段階的に試薬を添加していくのはなぜでしょうか。

追記です 削除/引用 No.10167-2 - 2022/01/11 (火) 20:06:31 - h 「白い浮遊物」は遠心後でも半ばから上にかけて存在し、ピペット動作で除去するのは困難です。

マウス肝臓のタンパク質ライセート 削除/引用 No.10167-1 - 2022/01/11 (火) 20:02:09 - h 医学系大学院生です。いつも参考にさせていただいております。 周りにわかる人がおらず、ネット等での検索でも出てこなかったので質問させてください（もし既出であればごめんなさい）。 ある遺伝子のノックアウトマウスに対して肝臓癌発生モデル（CDAHFD+DEN等複数種類）を作り、発癌や伸展との関連を調べております。 できた癌および非癌部の組織を切り取り、以下のプロトコルでタンパクを抽出しました。 １．組織とステンレスビーズを入れたチューブに1M HEPES 20uL, 100mM AEBSF 20uL, 20x cOmplete protein inhibitor, ddw 1860 uLを入れてビーズショッカーで破砕 ２．5M NaCl 10uL, 20% Triton X-100 25uLを加えて4℃, 40minロータリー。 ３．14000rpm, 10minで遠心 ４．supをprotein lysateとして使用 このときに、lysate内に白い浮遊物（voltexすると全体が白濁する）が視認されますが、これは脂質で宜しいのでしょうか。 この後にタンパク質定量をLowry法(脂質は関与しないはず)を基にしたDC protein assay(Biorad)で行っているのですが、その後のSDS-PAGEでタンパク量がバラバラだったり、そもそもprotein lysateが白濁しているのが気持ち悪いです。 肝臓に限らず同じような経験をされた方で何か解決策、もしくは「タンパク質定量には関係ないよ」等があれば、ご教授頂けると幸いです。

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