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(無題) 削除/引用 No.10165-6 - 2022/02/28 (月) 14:42:07 - ふえない 色々とご意見いただきありがとうございます。 ・安定発現は3クローンほど拾った後5週間維持してから凍結保存しました。凍結前までは特に不安定なことはなかったです。 ただ発現量はウェスタンで見た所どの株もだいたい同程度だったため中程度発現コロニーから株化できていないので、目的タンパク質自体の影響は見られていません。 ・現状6ウェルで融解後培養、その後2継代目くらいからハイグロマイシン添加で元気に育っていますが細胞密度が薄くなるとすぐにへたります（選択圧があるから当然か） ＞＞ちなみに２９３TにSV40oriをもつプラスミドをIntegrateすると染色体がかなり不安定になって細胞が変化しやすい …SV40ori有プラスミドでした 現状本細胞を用いたアッセイは実施できているので

(無題) 削除/引用 No.10165-5 - 2022/02/26 (土) 03:31:42 - おお >293T細胞にpcDNA3.1-HygRで遺伝子導入し、 コントロールの株は拾ってないの？発現したものによる影響なのか、２９３TのHeterogenicityによるものか判断ができそうな気がするけど。とにかくコロニーをExpandして増えた段階でストックしたならまだ細胞がアダプトしてなくって不安定なのかもしれない。 ちなみに２９３TにSV40oriをもつプラスミドをIntegrateすると染色体がかなり不安定になって細胞が変化しやすいようです（いいかどうかは置いといて）。

(無題) 削除/引用 No.10165-4 - 2022/02/25 (金) 19:34:00 - wertyu stableを樹立する際にクローニングされていると思いますのでたまたま凍結融解に脆弱なクローンを選んでしまったとかいうこともあるのかもしれません。樹立の際は、発現レベルの異なる複数のクローンか拾ってると思うのですが他のクローンも同様ですか。あまり高発現しているクローンだと小胞体ストレスとか凝集体形成とかでもともと弱くなってるかもしれないので、死にやすいかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.10165-3 - 2022/02/25 (金) 18:59:16 - KY 保存時に細胞が元気なのかは気になりますね。

(無題) 削除/引用 No.10165-2 - 2022/01/11 (火) 15:28:52 - ema 何をいれていらっしゃるのかわかりませんが、他のセルラインでの検討を何点か 戻した時点でセレクション株なのでハイグロマイシン入り培地で培養しているなら、抜いて、それなりに増えた時点でハイグロマイシンを入れる 60mmディッシュ1枚を30mm、6穴かで細胞密度をあげてみる 最初のみ10％FCSから15-20％FCSにして栄養リッチにしてみる などを行ったことがあります。 293T　死にやすいで検索して下記のような話があり、該当するようなら https://catalog.takara-bio.co.jp/com/tech_info_detail.php?mode=3&masterid=M100002278&unitid=U100004264 https://www.iqb.u-tokyo.ac.jp/5ken/Personal/ada-home/PROTOCOL.html

安定発現細胞の凍結ストック 削除/引用 No.10165-1 - 2022/01/11 (火) 09:34:17 - ふえない 安定発現についての現行トピックがありましたが丁度別件で悩んでおりますので相談させてください。 293T細胞にpcDNA3.1-HygRで遺伝子導入し、ハイグロマイシンセレクションを行った後、コロニー単離・培養、凍結ストックを作成しました。 この凍結ストックの細胞生存率が良くなく、困っております。 正確な生存率はまだ測定していないのですが、2×10^6/1mLで凍結保管していたものを60mmディッシュ1枚に起こして2~3本に1本は上手く増えるかなというところです。 凍結方法自体は他の細胞や無処置の293Tで上手くいっているものをそのまま使っているので、手技的な問題は少ないかと思います（セルカウント⇒市販凍結液で懸濁⇒バイセルで-80℃緩徐凍結⇒液体窒素保管）。 安定発現すると凍結保存（と融解）に脆弱になる事などあるのでしょうか。ご教示いただけますと幸いです。

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