BioTechnicalフォーラム [ローディングコントロールの個体差]

ローディングコントロールの個体差

No.10159-TOPIC - 2022/01/07 (金) 14:37:15 - よしこ

ラットから採取した組織をウエスタンブロッティングした際、タンパク相当量をそろえているはずなのに、ローディングコントロールがばらついてしまいます。

ローディングコントロールはβ-Actinを用いています。

Control群と曝露群で同じ部位の組織を採取するようにはしています。

同時にRNAの抽出も行っていますが、リアルタイムPCRのCt値はあまりばらついていません。

改善点など、アドバイスいただけると幸いです。

よろしくお願いいたします。
　

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No.10159-6 - 2022/01/11 (火) 23:30:33 - qq

同じ組織であればACTBのウェスタンが大きく変わる理由はなさそうなので、総タンパク量の見積もり（タンパク定量）に問題があるんじゃないかな。
他のコントロールになりそうなウェスタンでも同じような結果になれば強くそう思えると考えます。
ウェスタン後のPVDF膜をCBBで染色すれば、タンパク量がばらついていればわかるんじゃないかなと思います。

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No.10159-5 - 2022/01/11 (火) 18:13:00 - よしこ

返信の仕方がわからず、まとめての返答となることご容赦ください。

qq さん
同じ組織ですか、それとも異なる組織でしょうか？
→　同じ組織です。
ACTB以外に（例えば、GAPDHなど）他のコントロールも取ってみましたか？
→　細胞でのデータでACTBを使用しているため、極力揃えたいと考えており、別のものは測定しておりません（予算の都合もありますが、、、）。

TS さん、bhpさん
研究初心者のため、CBBやPonceauSの染色の経験はありませんが、バンドの確認も兼ねて実施してみたいと思います。

貴重なご意見やアドバイスをいただき、ありがとうございました。

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No.10159-4 - 2022/01/07 (金) 23:51:33 - bhp

β-actinやGAPDHが常に変化しないという保証はありません。またいわゆる内部標準に使われるタンパク質は量が非常に多く、シグナルがすぐ飽和したり多すぎてメンブレンから脱落したりしてあまり当てになりません。なのでメンブレンをCBBとかポンソーなどでタンパク質染色して等量ローディングしていることを示す方が説得力あります。定量するならレーン全体をスキャンするとかできます。15年くらい前はレビュアーから内部標準タンパク質は当然必須、総タンパク質染色ハア？みたいな圧力がありましたが、ここ４、５年の間にいろいろ問題点も指摘されるようになり、それもあってイメージングアナライザーのメーカーが、westernのシグナルと全タンパク質を同時にイメージングできるような試薬を売ってたりとかで、総タンパク質染色の重要性が認識される流れになってきてると思います。

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No.10159-3 - 2022/01/07 (金) 15:32:46 - TS

個人的にはしばしばあるのではないかと。

レビューワーによってはしつこくb-actinやれと言ってきますが、わたしはPonceauSの染色で補正しています。

PMID: 23747530

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No.10159-2 - 2022/01/07 (金) 14:55:14 - qq

同じ組織ですか、それとも異なる組織でしょうか？
ACTB以外に（例えば、GAPDHなど）他のコントロールも取ってみましたか？
タンパク相当量をそろえているはずなのに、そろっていないと感じていますか？
CBB染色してみましたか？

ローディングコントロールの個体差

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No.10159-1 - 2022/01/07 (金) 14:37:15 - よしこ

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