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(無題) 削除/引用 No.10150-17 - 2022/01/13 (木) 15:59:59 - おお >[Re:16] タウタウさんは書きました : > 精製したプラスとマイナスの分子が存在したら結合するのは当たり前。 それは流石に言い過ぎですよ。

(無題) 削除/引用 No.10150-16 - 2022/01/13 (木) 14:25:53 - タウタウ >[Re:15] おおさんは書きました : > 例えばほとんどKとRからなるペプチドがミトコンドリアへ移行するという話もありますし。 それこそが特異性のなせる技。 電気的相互作用だけでって、力の強さで言えば、イオン間の電気的相互作用は水素結合より１０倍の強さの最強の相互作用でしょう。 精製したプラスとマイナスの分子が存在したら結合するのは当たり前。 プラスとマイナスがくっつきました！って報告したら、えっ？　って思われるだけです。

(無題) 削除/引用 No.10150-15 - 2022/01/13 (木) 12:52:18 - おお >[Re:14] タウタウさんは書きました : > ほとんどのタンパク質は酸性なんだから、 > 正電荷のペプチドとの２つを混ぜたら結合しない状況を想定する方が難しい。 電気的相互作用だけでそこまで安定した結合が見れるかどうかと言うとそうでもないと思いますよ。例えばほとんどKとRからなるペプチドがミトコンドリアへ移行するという話もありますし。いろいろなタンパク質に結合するならそんな特異的な分布は取れないでしょう。 > それだけが示せても、特異性が示せなければ意味はない。 特異性は確かに何らかの形で示すべきですね。配列をスクランブルするとか、所々に電荷を持たないアミノ酸を挿入するとか（分子量は大きくなるけど）。

(無題) 削除/引用 No.10150-14 - 2022/01/13 (木) 12:17:18 - タウタウ ほとんどのタンパク質は酸性なんだから、 正電荷のペプチドとの２つを混ぜたら結合しない状況を想定する方が難しい。 それだけが示せても、特異性が示せなければ意味はない。

(無題) 削除/引用 No.10150-13 - 2022/01/09 (日) 22:34:41 - AAA Tracker様 ありがとうございます。 大変参考になります。 以前に試したELISAはペプチドを固相化していました。 ペプチドの蛍光標識は可能ですので、 タンパク質を固相化してそこにペプチドを反応させれば可能な気がします。 以前に試したELISAではプレートの底に-NH2が固相化されていて、そこに縮合剤を使ってペプチドのC末端をカップリングするというものでした。 側鎖が保護されていない状態のペプチドを縮合させることになるので、プレートの-NH2と-COOHが縮合するのと同時に、ペプチドに複数含まれる塩基性アミノ酸の側鎖の-NH2と別のペプチドの-COOHの縮合も生じてしまって、枝分かれした植物みたいなまったく別物のポリアミノ酸になってしまっているのでは？と心配していました。

(無題) 削除/引用 No.10150-12 - 2022/01/09 (日) 11:36:18 - Tracker 試されたELISAは固相がペプチドですか？ そうであれば固相にタンパクを、液相にビオチン (か、蛍光かRI)ラベルしたペプチドでやるのもありだと思います。 チャージが多いペプチドだと固相化効率が極端に悪くなる経験があるので

(無題) 削除/引用 No.10150-11 - 2022/01/07 (金) 11:34:03 - AAA 追記です。 ↓このダイアライザーなら溶液量が25~75μlで済むようです。 https://www.coleparmer.com/p/dispoequilibrium-dialyzer/26773

(無題) 削除/引用 No.10150-10 - 2022/01/07 (金) 11:13:30 - AAA おお様 ありがとうございます。若干複雑なプロトコルになりそうですが、参考になります。 まずは正電荷ペプチド単独で、通常のNativePAGE条件でトリス-グリシンバッファーで電流方向だけ逆転するという条件で流れるかどうか確認してみたいと思います。 これで泳動バンドが確認できれば、ご提示いただいたような条件で結合タンパク質を加えて、いろいろ試せそうですし、 そもそも最初の条件で泳動バンドが確認できないようなら、ゲルやバッファの条件を変更してみたいと思います。 電気泳動を使わない方法で比較的簡単そうな方法では平衡透析法のキットを見つけました。↓ ttps://www.thermofisher.com/jp/ja/home/life-science/protein-biology/protein-mass-spectrometry-analysis/plasma-protein-binding-equilibrium-dialysis.html これだったら使用するペプチドータンパク質量は若干多くなりそうですが、洗浄の工程はないですし、もしかしたら可能かもしれないと思いました。 そして、原理的には遠心による限外ろ過も類似したものではないかと思うので、先にアイデアとして上げた自分の考えもあながち邪道な方法でもないのかな？と思いました。

(無題) 削除/引用 No.10150-9 - 2022/01/07 (金) 08:26:11 - おお >まずそのペプチドだけを電流を逆向きで流す。 移動の速さと拡散を考えたらタンパクを正方向の電流で流してから、ペプチドをロードして逆方向に流したほうがいいかもとあとから思いつきました。

(無題) 削除/引用 No.10150-8 - 2022/01/07 (金) 03:52:09 - おお 思いついたことを２つほど、 あなたのその（リガンド）ペプチドが汎用のNative gelで逆方向に流れるなら、まずそのペプチドだけを電流を逆向きで流す。ペプチドが半分とかの位置に来たとき（このタイミングは検討がひつようかも）、一度電気泳動を止めて、Wellのグリセロールなどを洗い流してタンパクをロードして今度はタンパクが流れるように正方向に泳動する。想像できると思いますが、ペプチドはWellの方に向かって流れてタンパクは徐々にWellから離れてゆく。あるところでペプチドとタンパクが出会うわけで、タンパクに結合したものはフリーのペプチドと挙動を変えるので移動の仕方が変わり、それをゲル状で観察できる。 ネイティブで等電点電気泳動。 これはそのままです。ただしRunning Buffer付近はpHが両極端なので、少し注意がいる。またかなり時間がかかるので徐々に結合が外れるのなら、ちょっと解析しづらいかも。

(無題) 削除/引用 No.10150-7 - 2022/01/06 (木) 09:56:32 - AAA おお様 ありがとうございます。 ITCですね。 所属機関には装置がないのですが、外部利用できる施設はあるようですね。 ttp://ic.ims.ac.jp 検討してみます。

(無題) 削除/引用 No.10150-6 - 2022/01/06 (木) 09:25:50 - おお Isothermal titration calorimetryというのがあるよ。 https://en.wikipedia.org/wiki/Isothermal_titration_calorimetry

(無題) 削除/引用 No.10150-5 - 2022/01/06 (木) 09:06:19 - AAA おお様 ありがとうございます。 とりあえずペプチドとタンパク質の結合を確認したいのと、 可能ならフリーのペプチドのバンドの濃さからImageJなどを使ってBinding Affinityまで定量的に示すことができればベストと思っています。 １．よく考えたら、私の使用しているペプチドは低pHではタンパク質との結合が外れてしまう可能性のあるものでした。 あまり大幅な条件変更はせず、まずは通常のネイティブPAGEの条件で単純に電極を逆転させる泳動を試してみてもいいかと思いました。 ２．アガロースゲルを使う手法については下の文献を見つけました。 ttps://www.sbj.or.jp/wp-content/uploads/file/sbj/9805/9805_kaisetsu.pdf 今回使用するペプチドは分子量が2500くらいの小さいものなので、上手く見えるか微妙ですが、低分子量核酸分離用のアガロースを使ってみるのはどうだろうと思っています。 ３．それと電気泳動ではなく、若干邪道な気もするのですが、限外ろ過フィルターを使って結合を示せないだろうか？とも思っています。 手元に30kDaで分画できる、0.5mlの限外ろ過フィルターがあります。 ttps://www.merckmillipore.com/JP/ja/product/Amicon-Ultra-0.5mL-Centrifugal-Filters-for-DNA-and-Protein-Purification-and-Concentration,MM_NF-C82301#specifications ・予めペプチドを蛍光標識しておいて、 ・ペプチド単独、ペプチド＋標的タンパク質(200kDa)、ペプチド＋BSA(65kDa)をそれぞれ限外ろ過 ・標的タンパク質に結合したペプチドはろ過されずに残り、フリーのペプチドだけがろ過されるはず。 ・ろ液の蛍光強度から、フリーのペプチド濃度を計算 ・元のペプチド濃度から引き算して結合量を算出 免疫沈降やELISAの変法などいろいろ試したのですが、洗浄のステップで解離してしまうのかどうしても上手くいきませんでした。 この方法なら、電気泳動と同じく洗浄のステップがないのでもしかしたら上手くいくのではないだろうか？と思っています。 こういうBinding affinityの調べ方は一般的ではない気がするのでかなり不安ですが。

(無題) 削除/引用 No.10150-4 - 2022/01/06 (木) 01:34:06 - おお まあ通常の電流の向きで流す泳動でも、見れそうな気がしますけどね。DNAやRNAのゲルシフトなんてそのたぐいですし。 ゲルシフトのような条件ではペプチドは正電荷が強いので、流れないか反対方向に抜けていくかでしょうけど、タンパクの方はゆっくりと正方向に流れていくので、結合していればタンパクと同じ挙動を示すはずです。 フリーのペプチドの挙動も追いたいというなら、すこし分解能が落ちるかもしれませんがミューピッドのようなアガロースゲルでゲルの中央付近にWellができるようにコームを設置し、どちらの方向に流れてもゲル内で流れるようにすればできます。昔実習で酵素のIsotypeを判別するのにこのような電気泳動をしたことがあります。 おしめしのURLゲル内はpH４ぐらいですか？その条件であなたのタンパクは生理的な機能を保持していますか？

(無題) 削除/引用 No.10150-3 - 2022/01/05 (水) 13:13:19 - AAA βんjkl；様 ありがとうございます。電極を逆転させるという方法はありえるのですね。よかったです。 バッファーはトリス‐グリシン泳動バッファーではなく、酸性バッファに変えたほうが良いのですね。 酸性条件でのNative PAGEのプロトコルを見つけました。 ttp://wolfson.huji.ac.il/purification/Protocols/PAGE_Acidic.html ゲルは普段TEFCOのプレキャストゲルを用いているのですが、条件が特殊なので自作した方が良いでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.10150-2 - 2022/01/05 (水) 11:21:07 - βんjkl； Histoneとかribosomeタンパク質とかの強塩基性タンパク質の分析するのに酸性尿素ゲル電気泳動（running bufferやゲル作成用bufferの代わりに酢酸を使う）という電極を逆に接続して流動する古典的な方法があるけど、尿素不要なら尿素除いてやればいいと思う。酸性なので等電点の高いポリペプチドは電場におくとマイナス方向に流れる。いろいろバリエーションあるけど定番なのでネットで調べればやり方出てる。 問題はペプチドということなので、MWが少なくとも5000前後ないと(ある程度長くないと) そもそも電気泳動での分離には適さないかもしれない。

nativePAGEを使った正電荷ペプチドの電気泳動 削除/引用 No.10150-1 - 2022/01/05 (水) 10:44:34 - AAA いつも勉強させてもらっています。 ペプチドと特定のタンパク質の結合能を調べる実験をしています。 ELISAではどうしても複数回の洗浄のステップで解離してしまうのか、うまく調べられません。 そこでNative PAGEを使って、結合を調べられないだろうかと考えています。 たまたまこのペプチドが強い正電荷を持っているので、ペプチドに蛍光標識をつけてタンパク質と混合して+→-で電気泳動すれば、もしかすると複合体の形成によるバンドの遅延を示すことができるのではないか？と思っています。 ただそのような実験を行っている先行研究を見つけることができませんでした。 Native PAGEでペプチドを泳動する実験をされた経験があればご教示ください。またこのような実験系で電極を-→＋から+→-に逆にするというのはよくあることでしょうか？

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