Bio Technical フォーラム

  • バイオ関連の実験をする上での、試薬、機器、プロトコールなどの情報交換の場です。
  • 新しいテーマで話を始める場合、質問をする場合は「新しいトピックを作る」から書き込みをしてください。
  • 質問に対して解答できる方は是非、書き込んで下さい。
  • このフォーラムにふさわしくないと管理人が判断した投稿は予告なく削除します。

新しいトピックを作る　|　トピック一覧　|　研究留学ネットに戻る

ひとつ前のフォーラム（readのみ）

このスレッドをはてなブックマークに追加このスレッドをはてなブックマークに追加

TSAによる免疫染色増幅法について トピック削除
No.1014-TOPIC - 2012/10/12 (金) 04:07:32 - HIRO
よろしくお願いいたしいます。
In-situ hybridization後の免疫染色について質問です

マウス脳内の標的mRNAをRNAプローブでハイブリしています。しかし、RNAプローブが200bp程度と短いためか、シグナルが弱く、シグナルを増幅するためにTSA法を選択しましたがうまくいかず困っています。
　ご経験者がいましたら、コツを教えて下さい。
　もしくは、ほかの増幅方法でおすすめがありましたらご教示ください。

　プローブはDIGプローブで、はじめはこれにantiDIG-APとNBT/BCIPで発色していました。ハイブリ条件も調整しましたが、シグナルは弱いままで、しかしわずかなシグナルはある、という状況だったので、amplificationすることにしました。

ハイブリ後の実験方法の実際は以下です
サンプルはスライドグラスです
1)DIGプローブに対する抗体 をantiDIG-PODとし4C over night
　マレイン酸バッファー（Tween20含）で洗浄5min x 3
2)チラマイドビオチン（TSA）１０分
　　マレイン酸バッファー（Tween20含）で洗浄5min x 3
3)アビジンAP 30分
マレイン酸バッファー（Tween20含）で洗浄5min x 3
pH9.5に調整したTrisBufferで20分
4) NBT/BCIPで発色　3時間程度観察しながら終了

結果は、発色開始20分程度でサンプル？溶液？全体が染まるのでAPの活性とNBT/BCIPの反応は問題なさそうです。しかし、最終的にシグナルはほとんどなく、増幅しないantiDIG-APとNBT/BCIPでの染色より弱いほどです。

初心者ですが、袋小路に入り困ってしまい場違いかもしれませんが質問させていただきました。よろしくお願いいたしいます。
　
- このトピックにメッセージを投稿する -



全6件 ( 1 〜 6 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

(無題) 削除/引用
No.1014-6 - 2012/10/15 (月) 10:11:19 - 組織
ななし様

情報ありがとうございます。試してみます。

(無題) 削除/引用
No.1014-5 - 2012/10/15 (月) 09:09:11 - ななし
>[Re:4] 組織さんは書きました :

> 免疫染色で使ってるとフクシン系はバックが高い印象を持ってるのですが、そんなに違うのでしょうか？

10分を超える反応時間になると、ガラスにバックが出やすいので反応液を新調して再度発色させています。
組織上はブアンで固定しているせいか、ほとんど気になりません。

> ISHで試してみたいので、使われているニューフクシンのメーカーを教えて下さい。
MP Biomedicals
cat No. 155823
を使用しています。

> 抗体などの反応条件はNBT/BCIPと同じでいいのでしょうか？
比較したときの条件は、発色反応以外はすべて同一で行いました。

以上でよろしいでしょうか？

(無題) 削除/引用
No.1014-4 - 2012/10/14 (日) 12:25:01 - 組織
>[Re:2] ななしさんは書きました :
> AP染色ならニューフクシンを基質に用いた方がNBT/BCIPで染めるよりも感度がいいです。

免疫染色で使ってるとフクシン系はバックが高い印象を持ってるのですが、そんなに違うのでしょうか？
ISHで試してみたいので、使われているニューフクシンのメーカーを教えて下さい。
抗体などの反応条件はNBT/BCIPと同じでいいのでしょうか？

(無題) 削除/引用
No.1014-3 - 2012/10/12 (金) 12:17:28 - ななし
追記

当方ではNBT/BCIPでうっすら染まる条件なら、ニューフクシンでくっきりと染色されます。

(無題) 削除/引用
No.1014-2 - 2012/10/12 (金) 11:59:16 - ななし
AP染色ならニューフクシンを基質に用いた方がNBT/BCIPで染めるよりも感度がいいです。蛍光観察も可能です。

TSAによる免疫染色増幅法について 削除/引用
No.1014-1 - 2012/10/12 (金) 04:07:32 - HIRO
よろしくお願いいたしいます。
In-situ hybridization後の免疫染色について質問です

マウス脳内の標的mRNAをRNAプローブでハイブリしています。しかし、RNAプローブが200bp程度と短いためか、シグナルが弱く、シグナルを増幅するためにTSA法を選択しましたがうまくいかず困っています。
　ご経験者がいましたら、コツを教えて下さい。
　もしくは、ほかの増幅方法でおすすめがありましたらご教示ください。

　プローブはDIGプローブで、はじめはこれにantiDIG-APとNBT/BCIPで発色していました。ハイブリ条件も調整しましたが、シグナルは弱いままで、しかしわずかなシグナルはある、という状況だったので、amplificationすることにしました。

ハイブリ後の実験方法の実際は以下です
サンプルはスライドグラスです
1)DIGプローブに対する抗体 をantiDIG-PODとし4C over night
　マレイン酸バッファー（Tween20含）で洗浄5min x 3
2)チラマイドビオチン（TSA）１０分
　　マレイン酸バッファー（Tween20含）で洗浄5min x 3
3)アビジンAP 30分
マレイン酸バッファー（Tween20含）で洗浄5min x 3
pH9.5に調整したTrisBufferで20分
4) NBT/BCIPで発色　3時間程度観察しながら終了

結果は、発色開始20分程度でサンプル？溶液？全体が染まるのでAPの活性とNBT/BCIPの反応は問題なさそうです。しかし、最終的にシグナルはほとんどなく、増幅しないantiDIG-APとNBT/BCIPでの染色より弱いほどです。

初心者ですが、袋小路に入り困ってしまい場違いかもしれませんが質問させていただきました。よろしくお願いいたしいます。
全6件 ( 1 〜 6 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

パスワードを入力してチェックした記事を チェックした記事を

このトピックにメッセージを投稿する
名前 
メール  　アドレス非公開
   タイトル 
本文      
設定  クッキーを保存（次回の入力の手間を省けます）
上に上げない（トピックの一覧で一番上に移動させません）
解決（問題が解決した際にチェックしてください）
暗証  半角英数字8-12文字の暗証番号を入れると、あとで削除、修正ができます。
送信 
〔使い方〕
  • 「アドレス非公開」をチェックすれば、自分のメールアドレスを公開しないで他の方からメールを受け取れます。
  • 問題が解決した際には、解決ボタンをチェックして解決した旨のコメントをつけてください。これは、初めにトピックを作った人と管理人のみが可能です。
  • 半角カタカナ、機種依存文字(全角ローマ数字、○の中の数字等)は文字化けの原因となりますので使わないでください。