普通、制限酵素は10 unit/uL以上あって、1 unitあれば1 ugのDNAを1時間できることができることになっています。supercoilは酵素によって、様々に要求量が増えますけど。複数酵素で同時消化する場合は、supercoilに強い酵素が含まれていれば、それがlinearizeしてくれるので、supercoilに弱い酵素があっても酵素量を増やす必要はなくなります。
ともかく、最小限まで減らせばグリセロールの持ち込みは問題にならない場合が多いです。
あらかじめ酵素を希釈して使うということもあります。今はどうか知らないけど、酵素メーカーのカタログには、希釈して使用するときの推奨バッファーが記載されていたと記憶します。
また、マイクロピペットで量りとるより微量な酵素でいい場合、ピペットで吸わないで、チップをちょこっと浸けて付着したぶんだけ突っ込むという方法も、たしかMolecular Cloningに記載されていたような。
あるいは、グリセロール濃度が過剰にならないように使用する酵素量に応じて反応液量をボリュームアップして、消化後にエタノール沈殿しても良い。
それより、複数酵素の同時消化で、それぞれの至適バッファーが異なる場合のほうが問題のように思います。やり方によっては不完全消化、スター活性が顕著に生じます。
それと、古い酵素の活性をチェックしていたときに、
部分失活して不完全消化になった酵素は、酵素量を増やしても完全消化できないということがありました。失活した酵素が阻害的に働くのかもしれない。 |
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