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qPCRのプライマーのエクソンジャンクション トピック削除
No.10130-TOPIC - 2021/12/22 (水) 21:23:18 - hogehoge
qPCRのプライマー設計について質問があります。

私は、qPCRで用いるプライマーを設計する際は、必ずexon-exon junctionを含むように設計しています。これはゲノムDNA由来の産物の発生を抑えるためです。qPCRでは守らなければならないと教えられました。一方で、blast等を用いて自分で設計する以外にも、既報に記載のあるプライマーを使ってもよい、とも教えられています。

今回、新たに興味のある遺伝子のプライマーを設計しようと思い、既報を調べ、そこに記載のあるプライマー配列を試しにblastに入れてみました。すると、それらプライマーがexon-exon junctionを含んでいないことがわかりました。その1報が間違ってるのかと思い、さらに10報を参考にプライマー配列をblastにかけまくりました。結果、exon-exon junctionが含まれているものは1つもありませんでした。

そこで質問です。
qPCR用プライマーの設計時にexon-exon junctionを含めたほうがbetterではあると思っているのですが、含めずに設計したプライマーを用いることも多いのでしょうか。単純な疑問で、他ラボの研究者のご意見をお伺いしたく、ここに質問しました。

よろしくお願いします。
　
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(無題) 削除/引用
No.10130-4 - 2021/12/23 (木) 09:38:58 - -_-
RT(-)みたいなコントロールとればいいんじゃないの

(無題) 削除/引用
No.10130-3 - 2021/12/23 (木) 02:43:03 - PCR
>含めずに設計したプライマーを用いることも多いのでしょうか
そういう設計もたくさんあると思います。理屈の上では、DNase処理やカラムを通す処理でgenomic DNAは除けている（はずだ）から、ということになると思います。

ただ、身近な人にgDNAが除けているかどうかの確認をしたことがあるのかどうか聞くと「していない、でも除けているはず」という言葉が返ってくることが多かったです。研究がメインの仕事でない方だとこういう人もいるかな。

ついでに、私の経験だと（キットを使ったRNA抽出なんかでよくある）カラム処理だけでは十分にgDNA除けなかったです。


>設計時にexon-exon junctionを含めたほうがbetterではある
これはExon (n) と Exon (n+1) のつなぎ目にプライマーを設計するということであってますか？それとも、Exon (n)上にF-Primerを、Exon (>n+1)上にR-Primerを設計するということですか？

もし前者であれば、プライマーの3’側の半分程度が片方のExonにのっている設計だと5’側の半分がなんであれ増幅されることがあって、gDNAからも増幅されることがあります。私はこの経験があるのでプライマーは別々のエクソン上に設計するようにしています。

おおさんが仰るように、エクソンが一個だけの遺伝子も存在するので（案外にメジャーな遺伝子がエクソン一個だけでびっくりしたことがあります）、そういう場合はDNase処理をした上でgDNAからの増幅がないことを予備実験で確認してます。

(無題) 削除/引用
No.10130-2 - 2021/12/23 (木) 02:14:41 - おお
>qPCR用プライマーの設計時にexon-exon junctionを含めたほうがbetterではあると思っているのですが、含めずに設計したプライマーを用いることも多いのでしょうか。

頻度は把握していませんが、exon-exon junctionを含めずに設計したプライマーは見かけます。そもそもexon-exon junctionがないシングルエクソンの遺伝子がある以上それに合わせた精製のストラテジーが存在するわけで、いろいろな遺伝子を見るならそれに合わせるしかありません。マウスかヒトか忘れましたがGAPDHはイントロンを持ってないです。
その他にも理由と思われる点がありますが、うまくまとめれそうだったら追記致します。

qPCRのプライマーのエクソンジャンクション 削除/引用
No.10130-1 - 2021/12/22 (水) 21:23:18 - hogehoge
qPCRのプライマー設計について質問があります。

私は、qPCRで用いるプライマーを設計する際は、必ずexon-exon junctionを含むように設計しています。これはゲノムDNA由来の産物の発生を抑えるためです。qPCRでは守らなければならないと教えられました。一方で、blast等を用いて自分で設計する以外にも、既報に記載のあるプライマーを使ってもよい、とも教えられています。

今回、新たに興味のある遺伝子のプライマーを設計しようと思い、既報を調べ、そこに記載のあるプライマー配列を試しにblastに入れてみました。すると、それらプライマーがexon-exon junctionを含んでいないことがわかりました。その1報が間違ってるのかと思い、さらに10報を参考にプライマー配列をblastにかけまくりました。結果、exon-exon junctionが含まれているものは1つもありませんでした。

そこで質問です。
qPCR用プライマーの設計時にexon-exon junctionを含めたほうがbetterではあると思っているのですが、含めずに設計したプライマーを用いることも多いのでしょうか。単純な疑問で、他ラボの研究者のご意見をお伺いしたく、ここに質問しました。

よろしくお願いします。
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