Taroさん
ご回答ありがとうございます。
１）制限酵素で切ったベクターを、ゲル精製とかしていますか？その際UVを当てたりしていると、コロニー数が激減します。よほど切れない酵素でなければ、アルカリフォスファターゼ処理して、カラム精製すれば問題ありません。
→制限酵素はSpe1 Nco1で、処理後精製を行っております。コロニーは全くできない感じです。
２）ライゲーションのポジコンとして、ハイブリしたら制限酵素で切ったあとと同じ断片ができるような、適当な長さのオリゴを二本アニールし、リン酸化したものをインサートとして使うとよいと思います。それで生えたら、インサートが毒性があるのかもしれません。
→ポジコンではないのですが、ベクターのプラスミドを制限酵素処理してゲル抽出をする前のサンプル（使用するベクターと切り出されたいらない断片が両方入っているもの）をライゲーションしたらすごいコロニーができました。なので同じプラスミド由来のベクターとインサートはもう一度繋がるみたいです。
３）ベクター切断にXbaIなどメチル化に感受性がある酵素を使っていませんか？Double digestionだと切れていないのに気づかずに、しばらく悩んだ経験があります。
→酵素はSpe1、Nco1です。メチル化は気にしたことないので見てみます。 |
|
このスレッドをはてなブックマークに追加