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(無題) 削除/引用 No.10122-26 - 2021/12/26 (日) 07:59:46 - おお >また、大きなサイズのベクターだとゲルから切り出すと収率が5割を切ることもあってガッカリしていたのですが、これも私が欲張りすぎですね。 10ngあればコンストラクションを作るのに十分という世界で実験をしてきたので、収量は２の次でした。キットが普及する前はゲルを潰して一度凍結して遠心して液体部分を使うとか、ゲル潰したあと若干のTEとフェノールを加えて（どういうわけはフェノールクロロフォルム混液では良くないときいている）水溶液層をクロロフォルム処理エタ沈後使うという収量おそらく１０％ぐらいだろうという方法論がまかり通っていました。目的に合う量が取れればそれでいいというだけの話です。 他にもElectroelution という方法論もありましたね、興味があれば調べてみるといいかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.10122-25 - 2021/12/23 (木) 19:15:16 - G25 >切り出しをしてもdenatureしたと思しきバンドのコンタミが無視できないくらい入ってくる 切り出しのための泳動の時点で、がっつり見えるくらいdenatured plasmidが存在したっていうことになると思いますが、単に消化が不十分なだけだったりして。 以下、余談ですが、 最近、異なる制限酵素も単一のバッファーで切れるとか、改変型制限酵素やバッファー系も出ていますが、、、、 コンベンショナルな制限酵素で、至適バッファーの異なる酵素で同時二重消化するためのバッファーテーブルなんて、各社が出していたりしますけど、信用しないほうがいいです。異なる酵素をcompromiseする、これを両立ととるか、妥協と取るかといえば後者。不完全消化やスター活性がでるけど、一部はまともに切れた分子もある、程度のもの。その程度でもできる仕事にしか使えません。バッファーごとに順次消化すれば、起こらない問題。 で、そういった原因で起こる不完全消化でなくて、denatured cccが切り出し後にも目につくようでは、スタートのプラスミドにはもっとあったはずで、品質が悪すぎだろうと思うのです。

(無題) 削除/引用 No.10122-24 - 2021/12/23 (木) 17:32:47 - 分離能 すみません、お礼を書く前に送信してしまいました。連続投稿できないので時間があいてしまいました。教えてくださった皆さま、ありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.10122-23 - 2021/12/23 (木) 17:31:00 - 分離能 汎用性のあるベクターを使うことが多いので、通常は5マイクログラム程度を制限酵素処理・精製したものを凍らせておいて何年も使っています。そうすると私の手では切り出しをしてもdenatureしたと思しきバンドのコンタミが無視できないくらい入ってくるので、皆さんはどうされているのかと伺いました。私の場合は大きなスケールで切りすぎということですね。 また、大きなサイズのベクターだとゲルから切り出すと収率が5割を切ることもあってガッカリしていたのですが、これも私が欲張りすぎですね。

(無題) 削除/引用 No.10122-22 - 2021/12/23 (木) 11:46:18 - G25 >また、そのサイズのベクターをサブマイクログラム〜数マイクログラム泳動して、 普通、500 ngを目安でやっていますが、量に応じてレーンを太くしますし、 tailingして他のバンドにかぶるような量は流しません（厳密にはagaroseに吸着があったりして、先に流れたDNAが後ろのバンドに微量混じることを完全に排除はできませんけど）。 もちろん、ミニゲル(mupid)で十分。

(無題) 削除/引用 No.10122-21 - 2021/12/23 (木) 10:40:17 - G25 >one cutとdenatured formがちゃんと分離できますか？ denatured formというのが、いわゆるghost bandと呼ばれるcccが部分変性したものであれば、移動度はインタクトなcccとほぼ同じ、やや早く移動する程度なので（部分変性したプラスミドが多く存在するときはcccとdoublet bandになって見えます）、one cutとの分離は十分です。 ghost bandについては古くから論議されていて（文献はどれも古い）、Molecular CloningやQuiagenのマニュアルなどにでも触れられていたと思います。 制限酵素耐性のプラスミドはこのghost bandに当たるものです。量が多いと、消化後に電気泳動でチェックした時に見えるので経験した人も多いのではないかと思います。しかし多くの場合、intact cccの切れ残りだと誤認されているのではないでしょうか。量が少なければ、チェックの電気泳動では見えないかもしれませんが、ゲル抽出精製をしなければ、確実に夾雑してきて、その形質転換能力は intact cccと同等です。 ちゃんと切れているののがghostよりはるかに多く、目的の産物が十分にできる場合は、ghostによる非組換え体バックグラウンドはたいして問題になりません。しかし、非常に長いインサートを入れるとか、回復培養を全量蒔いても数個しか当りがでないなんてコンストラクトもあるわけで、そんなときghostの混入はクリティカルな問題になります。 一方、OCとone-cutの移動度は非常に近いですが、OCは制限酵素消化耐性になりませんので（ニックの部分で巻きの増減が逃されて解消するため）、未消化のOCがone-cutに混入することは実質的にありません。 ligation一反応に使うDNA量は数十ngのオーダー（概ね<50 ng)なので、ゲル抽出の収量で困ったことはありません。

(無題) 削除/引用 No.10122-18 - 2021/12/23 (木) 09:10:50 - s > ゲルからの抽出はどうやっておられますか？5kbを超えるようなベクターだと収率が落ちませんか。 最近はQIAGENのgel extraction kitのみですが、一回のligationやSLiCE等に使うのは高々数十ナノグラムなので、収率を気にしたことはありません。低いときでも50%ぐらいはいってると思いますが。 > また、そのサイズのベクターをサブマイクログラム〜数マイクログラム泳動して、one cutとdenatured formがちゃんと分離できますか？それでもやらないよりはマシという意見はあり得ると思いますが。 denatured form (form IV)との間の分離はできてるような気がしますが、open circularとの間は無理かも。やらないよりマシという考えでやっています。 UVトランスイルミネーターの話に戻りますが、波長によってエネルギーあたりのCPD yieldは3ケタ(3倍ではない)以上違ったはずなので、波長に言及しないで話をしても意味ないな、とは思います。

(無題) 削除/引用 No.10122-17 - 2021/12/23 (木) 07:35:41 - 分離能 本題とはズレますが、ベクター切り出し派の皆さん、教えて下さい。 ゲルからの抽出はどうやっておられますか？5kbを超えるようなベクターだと収率が落ちませんか。 また、そのサイズのベクターをサブマイクログラム〜数マイクログラム泳動して、one cutとdenatured formがちゃんと分離できますか？それでもやらないよりはマシという意見はあり得ると思いますが。

(無題) 削除/引用 No.10122-16 - 2021/12/22 (水) 19:55:58 - JJ 自分で色々考えて失敗するのも勉強なので、押し付けるつもりはありません。以下はおっさんの戯言です。 In-Fusionでもコロニーができないというのであれば、まずは精製したベクターのクオリティーを疑いますけどね。 UVは確実にクローニング効率を落とします。比べたことあります。30秒くらいなら大丈夫だったというような話はあくまでも経験則で、トランスイルミネーターの機種、UVランプのパワーと消耗度、コンピセルの効率、プレートの抗生物質濃度など、コロニーの数は様々な要素で変わってきます。 ＞脱リン酸化についてですが、平滑末端ではないのでゲル抽出すれば必要がない気がします。 NcoIとSpeIの位置が離れてるのか近いのか、わかりませんが、近いとしたら片方でしか切れていないベクターがコンタミします。こういうのは簡単にself-ligationするので、BGが高くなります。分子内反応ですので、インサートのライゲーション反応よりも効率が高いのでやっかいなことがあります。脱リン酸化していれば、ほぼ防げます。 ＞またゲル抽出と制限酵素後の生成は同じキットを使いますので、脱リン酸化のワンステップは余計な感じが致します。 アルカリフォスファターゼ反応は、制限酵素反応と同じバッファーで行えますよ。制限酵素と一緒に、もしくは30分後くらいにAPを加えれば大丈夫です。ゲル精製するにしても手間はかかりません。 ＞そもそもの問題が繋がらないことですので、脱リン酸化は僕の場合必要ないかなと思います。 それはそうですが、G25さんのいう通り、ゲル精製があやしいので、精製しないとしたらという話ですね。私は上記のように、手間は変わらないのでどちらにしても脱リン酸する派ですが。 インサートの毒性という可能性も捨てきれませんね。その可能性を検証・排除するコントロールは他の人が投稿していますね（合成オリゴのインサート）。

(無題) 削除/引用 No.10122-15 - 2021/12/22 (水) 14:16:39 - G25 いや、ゲル抽出が悪影響を与えている（UVがプラスミドを殺している）可能性があるから、ゲル抽出をやめて脱リン酸化したらどうかという提案ですよ。 質問のタイトルからそうですが、質問者や何人かの回答者は「繋がらない」ことが問題だと決めつけていますが、事実は「形質転換体のコロニーが出てこない」ことだけです。ligationがうまく行っていないのが原因だと決めつけるのは視野狭窄、非論理的じゃないですか。 ligationの問題ではないんじゃないかと匂わせる情報はあります。 コントロールとしてライゲーションしないベクターだけ形質転換してみればわかりますが、どんなにすんなり行く場合でも、あるいは組換え体が全然とれない場合でも、非組換え体のバックグラウンドコロニーは多かれ少なかれでるものです。 ところが、どうやら全然コロニーがでないようなので、ベクターが死んでるんじゃないかという、疑いを抱くのに十分です。そして、そこまで効果的にベクターを殺せる第一容疑者がUVです。 決めつけという点ではこれもそうなんですけれど >ゲル抽出は行わないとベクタープラスミドを切った不要な部分がライゲーションされてしまって大変なことになったのでしました。 不要な部分がライゲーションされたせいという根拠はあるんでしょうか。 実際は非組換え体のコロニーがたくさん出たというだけでしょ。 先の投稿にも書きましたが、精製の過程でアルカリ処理されたプラスミドは、多かれ少なかれ、部分変性で二重鎖に歪みを生じて制限酵素で切れない分子が混じります。いくら念入りに制限酵素消化しても、微量ではあっても切れないプラスミドは残り、効果的に形質転換体を生じます。ゲル切り出しで除去されるのはマルチクローニングサイトの切れっ端ばかりでなく、こうした切れ残りもそうです。 「不要な部分がライゲーションされてしまった」と言い切るなら、 ベクターだけライゲーションあり、なしで形質転換効率を比較するとか、裏付けが必要じゃないんでしょうかね。 視野狭窄、他の可能性をよく検討せず眼前にぽっと湧いて出たアイデアに疑いもなく食いつく、、、科学者の端くれとして常日頃、自戒しているところです。

(無題) 削除/引用 No.10122-14 - 2021/12/22 (水) 13:05:19 - KT 脱リン酸化についてですが、平滑末端ではないのでゲル抽出すれば必要がない気がします。そもそもの問題が繋がらないことですので、脱リン酸化は僕の場合必要ないかなと思います。

(無題) 削除/引用 No.10122-13 - 2021/12/22 (水) 12:53:25 - バベル え？皆さんのコメントを虚心に読んでますか？

感謝 削除/引用 No.10122-12 - 2021/12/22 (水) 11:09:09 - 繋がらない 皆さんご回答ありがとうございました。 脱リン酸化についてですが、平滑末端ではないのでゲル抽出すれば必要がない気がします。そもそもの問題が繋がらないことですので、脱リン酸化は僕の場合必要ないかなと思います。 またゲル抽出と制限酵素後の生成は同じキットを使いますので、脱リン酸化のワンステップは余計な感じが致します。 コンピテントセルも何種類か変えたのですが、同じ結果でしたので大腸菌の問題ではないように思います。 Nco1が問題となる意見についてはとても参考になりました！！！ 自分もいろいろ調べてみたのですが、やはりNco1が繋がらないというのを多く見かけました。ですのでNco1処理後に平滑化して再度Spe1で切るなどいろいろと対策してみたいと思います。 ご意見いろいろ頂いたので、打開策何個か思いつきましたのでやってみたいと思います。本当にありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.10122-11 - 2021/12/22 (水) 02:40:26 - おお ゲル精製はしたほうがいいだろうけど、コロニーは全然生えないんですよね。切れ残りのLigationが悪さしているならハズレのクローンがワンサカできるので今回のケースはそこではないと思います。 ゲル精製をするならやはりUVは気をつけてください。わたしは大昔は気にしないでうまく言ってたので何だそれって言う感じだったけど、取れないときはとことんだめという感じがしてます。銀紙でカバーしてレーンの端っこだけ直接UVが当たるようにしたりするようにしてます。 他のInsertではコロニーが生えているということなのでInsertがどうも大腸菌に悪さしているだろうと思えます。Transformationのヒートショックを３７度とか低温にする。プレートは室温から３０度でインキュベーションする。プレートの抗生物質濃度をできるだけ下げるといったことで、大腸菌内のプラスミドコピー数を下げたりして大腸菌に対するそのプラスミドの影響を抑えるのはやってみてもいいかもしれません。また大腸菌に悪さするような配列を持つプラスミドだと大腸菌のグロースは遅くなりますので、２日待ってみてもいいかもしれません（ただし、それだけ長いと酵母類も生えてくるので見極めも必要かもしれません）。 NcoIは若干気難しい酵素です。たしかNEBのカタログ（おおむかしの）に精製度合いの低いDNAは切れにくいと書かれています、PCR後どのようにしているかわかりませんが。もしRCR Purification Kitを使っているならそれで十分なのかもしれませんが、それでもというなら、PCR産物にSDSとPKを加えてタンパク類を消化してからRCR Purification Kitというような事も試してもいいのかもしれません。わたしはあまりそういうキットを使いません。飽和した尿素を等量加えたあとエタ沈してます。 InsertにつかうPCR産物は一度そのまま末端をリン酸化するかTAクローニングを使って（クローニングするしか機能がない）クローニングベクターに入れてそこからそういう酵素で切り出すのが確実かもしれません、確実に切れたInsertを作ることができますので。PCR産物よりプラスミドから切り出したDNAのほうが効率が良かったりするのは諸説、いろいろ言われていますがまあその議論は２の次なので書きません。 あと加えて単なる印象なのですが、Constructionで使うように作られた非常に効率のいいコンピテントであれば、直鎖になったプラスミドでも若干のコロニーが生えてくるものです。全くコロニーが生えないならコンピなのか、あるいは何らかの他の要因なのかわかりませんが、万全でないところがあるような気もしてます。

(無題) 削除/引用 No.10122-10 - 2021/12/21 (火) 21:28:20 - Taro ＞ゲル抽出は行わないとベクタープラスミドを切った不要な部分がライゲーションされてしまって大変なことになったのでしました。 ＞収量がかなり減りましたがいけると判断 ですから、脱リン酸化はしましたか？制限酵素と一緒にShrimp Alkaline Phosphataseなどを1-2uL加えるだけです。 脱リン酸すれば、切れ端がライゲーションすることもありません。ベクター同士のライゲーションも防げます。 読む限り、このケースは、ゲル精製が一番あやしいと思います。納得できないのであれば、精製済みのベクターに、リン酸化・アニール済みオリゴをライゲーションすればはっきりします。生えればベクターは問題なしでしょう。 もちろん、ちゃんとやればゲル精製しても大丈夫ですが、私の場合はかかる時間と手間の割に合わないので、たまに切れにくい酵素を使うとき以外はやりません。

(無題) 削除/引用 No.10122-9 - 2021/12/21 (火) 21:24:29 - toto それは、ベクターとの配列の相性が悪いのかなという気はします。NcoIでのクローニングはあんまりいい思いは個人的にはないですが、In-Fusionでも入らないのなら、そっちの可能性かなと思います。ベクターを変えるのが早い気がしますが、面倒な場合はコンピをStbl３か４、あるいは古典的なSURE2などにしてみるか、でしょうか。

ゲル抽出 削除/引用 No.10122-8 - 2021/12/21 (火) 20:29:11 - 繋がらない ゲル抽出は行わないとベクタープラスミドを切った不要な部分がライゲーションされてしまって大変なことになったのでしました。 収量がかなり減りましたがいけると判断 インサートはPCR産物がきれいにシングルバンドで、テンプレート量もかなり絞ったので制限酵素消化後精製だけして使用しました。 ですが繋がりません。 あらゆる考えられる原因は潰してみたんですが、やはり繋がりません、

(無題) 削除/引用 No.10122-7 - 2021/12/21 (火) 19:44:34 - s 自分も大抵ゲル精製はしますね。 312 nmのトランスイルミネーターで30秒程度で切り出す限り、クローニングに困るほど効率が低下した記憶がないです。UV-Aやブルーライトを使えばより安全だとは思いますが、見にくいので結局UV-Bになってしまいます。 最近は売ってるのか知らないけど、UV-Cのトランスイルミネーターで切り出して「クローニングできない!」と何ヶ月も悩んでいる人が昔近くのラボにいました。

(無題) 削除/引用 No.10122-6 - 2021/12/21 (火) 18:57:24 - G25 >ゲル精製する必要はないと思います そこまでは言わないけど。 私は、二重消化しようと脱リン酸しようと、基本的にゲル抽出する流儀。 アルカリ法でとったプラスミドは、原理的に100%の分子が制限酵素で切れるわけではなく、切れ残りから生じるバックグラウンドが時としてクリティカルなため、切れ残りを排除するためのゲル抽出。 UV被曝を排する工夫をするなら、ゲル抽出はおそるるに足らず。

(無題) 削除/引用 No.10122-5 - 2021/12/21 (火) 18:34:50 - Taro そうですね。ベクターを切ったあと、ゲル精製する必要はないと思います。もちろん脱リン酸する前提ですが。

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