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(無題) 削除/引用 No.10121-3 - 2021/12/21 (火) 12:16:47 - おお ベクター側を脱りん酸化して、セルフライゲーションの中に埋もれてします目的のクローンが見つからないという懸念を払拭しないと普通は難しいです。ただし、ベクター側を脱リン酸化してしまうと普通はPCRプライマー側にリン酸がついてないのでライゲーションできなくなります。 ただし、特にPCR産物が短く、Taqのように末端に余分な塩基をつけるような酵素でなければ、PCR産物を大過剰（見かけのTransformation活性が激減するぐらいの量）と脱リン酸化してないベクターでLigationするとできるという話は聞いたことがあります。 正攻法はPCR産物をリン酸化することです。また、もしTaq系の酵素を使っていたらPCR産物もBluntingをするか。dNTP存在化で平滑末端になるようなPCR用酵素で数分処理して平滑にしてください。

(無題) 削除/引用 No.10121-2 - 2021/12/21 (火) 10:35:52 - AA PCR産物が平滑末端なら基本できるんじゃないでしょうか。 といいますか、末端平滑化のキットの目的ってそういうものじゃないんですか？ Taqではだめでしょうが、最近のHiFi酵素は基本的に産物は平滑末端だと思います。 ちなみに平滑化したらTAクローニングはできなくなります。

PCR断片のライゲーション 削除/引用 No.10121-1 - 2021/12/21 (火) 10:19:16 - ライゲーション ベクターとなるプラスミドを制限酵素処理して突出末端を作ってあるとして、この突出末端をBlunting Kitなどで平滑化した場合、なにも処理していないPCR産物をインサートとして直接ライゲーションできますか？それともtaqによってはベクターをTAクローニングができるようになんらかの処理する必要がありますか？

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