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(無題) 削除/引用 No.10120-3 - 2021/12/22 (水) 01:31:27 - ゆあ egeriaさん ご回答ありがとうございます。 なるほど、たしかに選択培地のzeocin濃度をさらに下げるというのは盲点でした。 15μg/mL→5μg/mLにしたときにコロニーがぶわっと出た前例もありますので、 私もギリギリまで濃度を下げてやってみようと思います。 ありがとうございます！

(無題) 削除/引用 No.10120-2 - 2021/12/21 (火) 12:08:30 - egeria pChlamy_4を使った経験があります。正しく導入されていればコロニーは7-10日で見えます。 ただし、ゼオシンはクラミドモナスに対して効果が強すぎるため使いにくい印象です。私も5 ug/mLではほとんどコロニーが取れず、2 ug/mLまで下げてようやくまともに取れた記憶があります。strainや薬剤メーカーによってゼオシン感受性が異なるので、形質転換をせずspreadしたときに全滅する最低濃度がどれくらいかを自分で調べ、ギリギリの濃度でセレクションするのがいいと思います。 pChlamy_4を使う必要性がなければ、個人的にはハイグロマイシン・パロモマイシン・スペクチノマイシンのいずれかでセレクションするベクターを使うのがおすすめです。pChlamy_1やpChlamy_3がハイグロマイシン耐性でしたが、もう販売していないかもしれません。

エレクトロポレーションしたクラミドモナスが増えない 削除/引用 No.10120-1 - 2021/12/21 (火) 02:03:03 - ゆあ はじめまして。質問させてください。 タイトルの通りです。クラミドモナスの場合はコロニーが通常1週間ほどで見えてくると聞きますが、生えてきません。 その代わり、生えてこない選択培地をそのまま放置していると、3-4週間後くらいに1個か2個出てくることがたまにあります(事情がありまだinsert check出来ていないのでこれが当たりかどうかは分かりません・・いずれにせよ3-4週間かかるのはおかしいですよね）。 使用するDNAは鎖状の7kbpくらいで、使用機器はNEPA21です。 目的は部位特異的変異導入です。 クラミドモナスおよそ4×10^5 cellに対し、DNA400ngを使用しています。 ベクターはpChlamy_4という製品です。 エレポンに使うbufferと、エレポン後の回復培養には、どちらもTAP液体培地にスクロースを添加したものを使っています。 回復培養は24時間行い、選択培地はzeocin 5μg/mLのTAP寒天培地を使用しています。 工程のなかで、氷やボルテックスは一切使っていません。 ただ引っかかるのが、数カ月前、ずっとzeocin選択培地の濃度を15μg/mLで使用していたのを5μg/mLに変えたときのみ、たった一度だけ、ブワッとコロニーが出ました。 そのためzeocin濃度を5μg/mLに変えましたが、その一度きり以降、また一切コロニーが出ません。なにが良かったのか未だに分かりません。 電圧やパルス長さは色々な文献を見ながら条件検討しましたが全てダメでした。 もう何ヶ月もエレポンしてておかしくなりそうです。 ちなみに大腸菌(DH5α)形質転換はいくらでも成功してます。 クラミドモナスが曲者なのと、私の手技に何かあるんだと思います。でももう何を検討したらいいのか分かりません。 なにか改善出来そうな余地があれば教えていただけないでしょうか。 本当に何でもいいです。 よろしくお願いします。

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