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血清サンプルのウエスタンブロットについて トピック削除
No.10118-TOPIC - 2021/12/20 (月) 10:56:46 - やま
現在、初めてウエスタンブロットを行っているのですが最初のサンプル調製のステップで気になった点があったので質問させていただきました。

最初に、タンパク濃度をそろえるために
@血清をTCAによりタンパク沈殿
A0.1M NaOHで溶解
Bブラッドフォード法によりタンパク濃度を測定
C測定値を元に、元の血清をウエスタンブロットのサンプルとして使用
という流れで行っています。

ですが、その後のウエスタンブロットの結果を見ると濃度があまりそろっていないように感じます。
上記の方法で、測定方法に問題は無いでしょうか？


初歩的な質問で申し訳ありませんが、よろしくお願い致します。
　
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No.10118-7 - 2021/12/24 (金) 11:04:25 - やま
皆様、様々なご意見ありがとうございました。

その後、メンブレンのCBB染色によりタンパク濃度はサンプル間で大体そろっていることが分かりました。
今後は、アルブミン等のバックグラウンドを消すために抗体の希釈やご紹介いただいたアルブミン除去キット等を行っていこうと思います。

(無題) 削除/引用
No.10118-6 - 2021/12/22 (水) 12:22:18 - warty
血清の場合、アルブミンが大半を占めるという特殊事情のため、微量蛋白質を検出しようと思うと通常の蛋白質量の数倍＜アプライしないと検出が困難なことがしばしばあります。しかしこれをすると今度は大量のアルブミンが泳動を乱してデータが大変汚くなったり、非特異的な反応を呈したり免疫グロブリンが２次抗体と反応したりして良好な結果が得られないこともよくあります。分析対象とする蛋白質がきまっているならばあらかじめ50%飽和硫安分画（この場合透析も必要）とかブルーセファロースなどでアルブミンを除去してから蛋白質濃度を合わせてwestern blottingに供した方が良いような気がします。便利なアルブミン除去キットは市販もされてたと思いますので検討ください。

(無題) 削除/引用
No.10118-5 - 2021/12/22 (水) 10:51:49 - qq
>ウエスタンブロットの結果を見ると濃度があまりそろっていない
とは、どういうことでしょうか？
ウェスタン後のPVDF膜をCBB染色すると、血清アルブミンのバンドの濃さがバラバラだったということですか？
各レーンに乗せているタンパク量がそろっているかどうかは、CBB染色やポンソー染色してみれば、すぐに分かるんじゃなかろうか？

(無題) 削除/引用
No.10118-4 - 2021/12/22 (水) 09:12:28 - やま
ご返信ありがとうございます。

ブラッドフォードはアルカリ不可では？というご質問ですが、自分が使用しているキットでは0.1M NaOHは溶媒として使用可能とあったので使用しております。
説明不足で申し訳ありませんでした。

血清については、最終的にウエスタンに使用するサンプルは希釈して使用しております。また、TCA沈殿を行った理由としては、濃縮というより精製により夾雑物を取り除いてから濃度を測定したいという意図でした。

以上を踏まえての再度質問したいのですが、血清中の少量目的タンパクをウエスタンブロットによって定量する際は、アプライ量を合わせれば大丈夫という理解でよろしいのでしょうか？

(無題) 削除/引用
No.10118-3 - 2021/12/21 (火) 09:29:39 - ｑ
濃縮の是非はともかく、
bradford法はアルカリ不可では？

(無題) 削除/引用
No.10118-2 - 2021/12/20 (月) 18:04:22 - ＠＠
血清は蛋白質濃度が半端なく高いので、希釈することはあっても、TCAで沈殿、濃縮する必要はないと思うのですが。

血清はタンパク質濃度＝アルブミン濃度みたいなものですし、蛋白質濃度測定して蛋白質量を合わせてアプライしてもあまり大きな意味はないと思います。むしろ液量で合わせた方が良いのではないでしょうか。

血清サンプルのウエスタンブロットについて 削除/引用
No.10118-1 - 2021/12/20 (月) 10:56:46 - やま
現在、初めてウエスタンブロットを行っているのですが最初のサンプル調製のステップで気になった点があったので質問させていただきました。

最初に、タンパク濃度をそろえるために
@血清をTCAによりタンパク沈殿
A0.1M NaOHで溶解
Bブラッドフォード法によりタンパク濃度を測定
C測定値を元に、元の血清をウエスタンブロットのサンプルとして使用
という流れで行っています。

ですが、その後のウエスタンブロットの結果を見ると濃度があまりそろっていないように感じます。
上記の方法で、測定方法に問題は無いでしょうか？


初歩的な質問で申し訳ありませんが、よろしくお願い致します。
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