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抗原タンパク作製時のシャイン・ダルガノ配列 トピック削除
No.10114-TOPIC - 2021/12/18 (土) 11:01:26 - SD
抗体を作製するための抗原を作る目的で大腸菌でタンパク質を強制発現させようとしています。目的タンパクの発現ベクターを作製するにあたって、シャイン・ダルガノ配列は入れておくべきでしょうか。coding seq のみでベクターを作成してもタンパク質の収量に影響はないでしょうか。収量はそういう点よりもタンパク質そのものの可溶化のしやすさに依存するでしょうか。
　
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No.10114-9 - 2021/12/20 (月) 15:35:49 - G25
SD配列は開始コドンから10 nt前後（概ね8 nt)から大きく外れると効果的でないとされています。

前にも書いたようにタグから翻訳開始させて目的遺伝子のCDSをin-frameでつなぐのが一般的です。N末タグなしにCDSからいきなり翻訳開始させるというのはかなり特殊なんですけれど、なぜ、そうしようとしているのでしょうか。
pETシリーズにも組込む遺伝子のSD配列＋開始コドンで始めるデザインのがあったり、 開始コドンにNdeIを重ねて、ATGで始まるCDSを直結させるとSD配列が丁度よい配置になるベクターとかあるにはあるんですけど。


具体的に使用するベクターを使用しようとしているのかとか、
どういう融合タンパク質にしようとしているのか（あるいは融合させないのか）とか（これは目的タンパク質の精製戦術にも関係しますし）、
先にプランがあるはずなので、その情報をまず明らかにしないと、埒あかないように思います。

(無題) 削除/引用
No.10114-8 - 2021/12/20 (月) 12:16:48 - おお
先程示したURLなどをみていたらピンと来ると思いますが、SD配列はRBSと記されている事があります。

(無題) 削除/引用
No.10114-7 - 2021/12/20 (月) 09:20:39 - おお
>マルチクローニングサイト内のどの制限酵素で切るかでそこの部分の長さが変わってくると思いますが。。



すでに指摘がありますが、N末にタグがついてないのですか？GSTとか６xHisとか。

(無題) 削除/引用
No.10114-6 - 2021/12/20 (月) 09:18:18 - おお
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC139613/

https://www.thermofisher.com/us/en/home/references/ambion-tech-support/translation-systems/general-articles/ribosomal-binding-site-sequence-requirements.html

(無題) 削除/引用
No.10114-5 - 2021/12/19 (日) 13:48:46 - SD
みなさま
ありがとうございます。なるほど、ベクター側にあるのですね。ちょっと安心してきました。調べてみます。
アドバイスを踏まえてもう一つ追加で教えてください。SD 配列と開始コドンの間に何ベース存在するかはあまり気にしないで良いのでしょうか。マルチクローニングサイト内のどの制限酵素で切るかでそこの部分の長さが変わってくると思いますが。。

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No.10114-4 - 2021/12/19 (日) 10:06:14 - G25
定法どおりの融合タンパク質なのであれば、留意すべきはコドンフレームです。

(無題) 削除/引用
No.10114-3 - 2021/12/19 (日) 10:03:34 - G25
そういう目的のベクターなら、ベクターの方に備えられているのが普通だと思います。
N末タグとの融合タンパク質ならタグの前に翻訳開始配列が付いているわけですし。
発現タンパク質に活性を持たせるために、C末タグにする、あるいはあえてタグなしにするというケースはあり得ますが、抗原にするのが目的ならそこまでしてないと思うのですけど。

(無題) 削除/引用
No.10114-2 - 2021/12/19 (日) 09:30:40 - おお
シャイン・ダルガノ配列がないとリボソームが認識しないので翻訳がされません。ただし大腸菌発現用べくたーであればベクターにすでに備わっている可能性があります。お使いになるベクターをまずはご確認ください。

抗原タンパク作製時のシャイン・ダルガノ配列 削除/引用
No.10114-1 - 2021/12/18 (土) 11:01:26 - SD
抗体を作製するための抗原を作る目的で大腸菌でタンパク質を強制発現させようとしています。目的タンパクの発現ベクターを作製するにあたって、シャイン・ダルガノ配列は入れておくべきでしょうか。coding seq のみでベクターを作成してもタンパク質の収量に影響はないでしょうか。収量はそういう点よりもタンパク質そのものの可溶化のしやすさに依存するでしょうか。
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