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(無題) 削除/引用 No.10091-8 - 2021/12/12 (日) 10:58:57 - おお ちょっと時間が立ってしまいましたが、色々アドバイスも出ているようです。 それに加えてですが、同僚とかにうまく行っているサンプルとプライマー（あなたの対象の遺伝子でなくてもいいでしょう）を分けてもらって、あなたの手で増幅できるか確認してみるといいです（同時にあなたのサンプルもPCRするのがベストです）。 両方かからなければ、あなたの手技やあなたが使っているなにかに問題がある可能性が高いです。 同僚のサンプル、プライマーのほうがかかり、あなたのサンプルがかからないなら、共通してない何かがおかしいことになります。それはプライマーとかかもしれません。プライマーがなにかの理由で（分解とか、コンタミとか）ワークしなくなったのであれば、おおもとがあればそれを起こしてくるか、購入し直すかという考えに至るかもしれません。 またプライマーセットの特性はそれぞれ大きく異なります。かからないプライマー、かかりにくいプライマー、ある酵素に相性がいいプライマー、条件がある程度揃わないとかからない扱いが難しいプライマーもあり、逆に何がどうころんでも増幅できそうなプライマーもあります。 で言いたいことはそのプライマーの至適条件が狭いためどこか微妙な違いでかからないとか言う可能性です。まあそれならプライマーを設計し直すのも視野に入ります。その前にやれそうなこととしてはタッチダウンを試してみてください。ゲノムとか複雑性の高いサンプルから特異的な配列を増幅させるには優れた方法です。細かいことはタッチダウンPCRとかで検索してみてください。

(無題) 削除/引用 No.10091-7 - 2021/12/11 (土) 21:01:03 - トラブルシュートも意外と楽しい 1.同じゲノムDNAサンプルで他のコントロール遺伝子（bアクチンでも何でも）を増幅してみる。バンドが見えるならプライマーの問題。 2.標的となる遺伝子配列が入ったプラスミドをテンプレートにして同じプライマーを使ってPCRをかけてみる。バンドが見えるならサンプルDNAの問題。 3.上記のPCRサンプルを2台の別々のPCRマシンにかける。機器やプログラムの問題なら同じサンプルなのにバンドの出方が異なる。 4.上記のPCRサンプルを1枚のアガロースゲル上で流す。当然DNAラダーも一緒に。ゲルの作成に問題があるならDNAラダーすら見えないし、ラダーは見えているのに他のPCRサンプルが増幅されていないなら酵素またはバッファーの問題。 5.酵素、バッファー、水を全て新品に取り替えて再度1-4を繰り返す。 6.それでもダメなら信頼できる別のスタッフにその人のベンチ、ピペット、PCRチューブを使って全く同じ事をやってもらう。 さあこれでどうだ！

(無題) 削除/引用 No.10091-6 - 2021/12/10 (金) 23:13:36 - もち丸 回答頂きありがとうございます。 一度上手く行ったサンプルで行っております。dNTPもバッファーも共通のもので、kod fx neo純正のものです。酵素も共通で、問題なく働いているようです。 アルカリ抽出法については行ってみたのですが全くバンドが出なかったのでProKで抽出する方法にしています。 PCRプログラムは今日確認してみましたが、間違いなかったです。 今までは私がやっても上手く出ていたのですが、突然出なくなってしまいました…

(無題) 削除/引用 No.10091-5 - 2021/12/10 (金) 18:16:15 - AA ジェノタイピングのようなルーティンワークの場合、うまくいっていたものがうまく行かなくなったのであれば、メソッドの問題ではなく手技の問題であるケースがほとんどです。 「ラボ全体ではうまくいっていた」が「質問者さんが初めて挑戦したらうまくいかない」 のか、 「質問者さん自身もこれまでうまくできていた」が「今は誰がやってもうまくいかない」 のか、など状況によって考えられる理由が変わると思いますのでそのあたりから整理されると良いかと思います。 私の身の回りであった予期しない原因の例としては、 ・学生が保存されていた判定用のPCRプログラムを書き換えていた ・TE飽和フェノールのpHが違った(低かった) ・使用期限の切れた酵素が新品として届いた　(ロット番号から判明) などがありました。

(無題) 削除/引用 No.10091-4 - 2021/12/09 (木) 02:30:35 - おお いままででうまく行っていたサンプルは残ってますか？それがかかるかかからないかで方針を絞れると思いますので。 dNTPも共通のものですか？ いつもMg添加済みバッファーを使っているのに、たまたまMg添加していないバッファーを使ってしまったとか（その酵素についてくるバッファーは知らないけど）？ よくわからなければ抽出したDNAを一度エタ沈してみるというのも。わたしは６Mほどの尿素が入った状態でよくエタ沈します（これでかなり夾雑物が抜けるので）が、普通のエタ沈でもそれなりにじゃまになりそうなものが抜ける。ProKならSDS使ってますよね（まあ普通は一度エタ沈したら抜けるはずのものですけど）。

(無題) 削除/引用 No.10091-3 - 2021/12/08 (水) 21:14:32 - p うちらはtail からのDNA抽出はproteinase K法でなくNaOH法でやってます。初心者がいきなりやってもすぐできるくらい簡単で、genotypingもちゃんとできてます。細部で異なるいくつかバーションあるみたいですが、その中でも一番シンプル（短時間　アンド　簡単）なものでやってます。ネット検索すればすぐ見つかると思います。

(無題) 削除/引用 No.10091-2 - 2021/12/08 (水) 19:18:27 - ココア 私もgenotypingをやってますが、ProKを使わない方法に変えました ProKなぞ使わなくてももっと短時間でPCRできることに気付いたので KOD Fx Neo、私も使ってます 安定してバンドを見れてるので、かなり助かってます

ノックアウトマウスのジェノタイピングについて 削除/引用 No.10091-1 - 2021/12/08 (水) 16:42:43 - もち丸 いつも参考にさせていただいております。 件名のとおりノックアウトマウスのジェノタイピングについて質問させていただきたいです。4週齢のマウスのtailからProteinaseKでDNAを抽出し、KOD FX NEOを用いてPCRにかけているのですが今までバンドが確認できた条件でも、バンドが見えなくなってしまいました。Templateの量が多すぎるのかと考え、MillQで1/10希釈と1/100倍希釈を行って0.3ulをPCRに供したのですがバンドはありませんでした。プライマーの凍結融解も考え、一度しか凍結融解していないプライマーで試してみたのですが、これもバンドが見られなかったです。アニーリング温度についても60℃まで低くしてみたのですが、これも上手くいきませんでした。サンプルをNanodropで測定したところ、260nmにピークがあり、濃度も1000 ng/ulとなっていたため抽出は上手くいっていると考えています。酵素も研究室内の他の方が用いていて問題は起こっていないとのことなのですが、失敗する原因として何が考えられるか教えていただきたいです。

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