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(無題) 削除/引用 No.10063-8 - 2021/12/01 (水) 17:09:25 - AA ヘテロで良い、ということは野生型タンパクが存在しても良いということですので、s様のご意見が合理的なように私は感じます。 二者択一、というよりも各々の点変異がどのような機能変化をもたらしているか、というようなスクリーニング段階ならいちいち株化するのは時間も手間もかかりすぎてしまいます。 (1変異につき数枚の96穴ディッシュ、それが30も40もあったら・・・) 一過性発現だと困るということならpiggybacの系でゲノムに入れることもできます。例えば5個ずつ変異をプールにして表現型の出るプールについてそれぞれさらに単独の導入をしてみる、などしてみればスクリーニング効率もあげられると思います。 色々してみて面白そうな表現型があるなら最終的に株化する、ということでよいのではないでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.10063-7 - 2021/12/01 (水) 14:43:04 - s もちろん、30~40種類のmutant cDNA constructをそろえるのと、1%程度の効率で30~40種類のCripsr/ssODNベースのknock-inをするので、どちらが労力が少なくて済むかという問題になりますが。

(無題) 削除/引用 No.10063-6 - 2021/12/01 (水) 11:47:44 - s ヘテロ挿入と書いておられますが、野生型アレルがあって構わないなら、ゲノム編集ではなく単純にmutant cDNAのtransfectionではだめなのですか。野生型アレルを除きたいなら、遺伝子破壊後にtransfectionすればどうでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.10063-5 - 2021/12/01 (水) 00:20:31 - 名前？ ＞＞ ｓ様 ご返信ありがとうございました． 情報が足りず申し訳ございません． エクソンに変異を入れてアミノ酸配列を変化させ，細胞を使ってタンパクの機能解析をする予定の実験です．

(無題) 削除/引用 No.10063-4 - 2021/12/01 (水) 00:12:36 - 名前？ ＞＞ AA様 ご返信ありがとうございました． 一般的にはシングルセル化したうちの1%程度がSNP導入なら十分「ハイスループット」　そうなんですね・・・ はい，ヘテロ挿入を考えているのですが，シングルセル培養と配列決定がすごーーく手間と言われました・・・． 10個くらい作るのならなんとかできるのではと言われたのですが，30個や40個のSNP＋細胞を作るのは，CRISPRを離れたもっと別のアプローチとかも視野に入れる必要があるのかな？と思っていました．．．

(無題) 削除/引用 No.10063-3 - 2021/11/29 (月) 13:23:56 - s アミノ酸変異を入れたいという話なのか、非コード領域のSNPなのか。前者なら、ゲノム編集にこだわる必要があるのか。情報が足りないように思います。

(無題) 削除/引用 No.10063-2 - 2021/11/28 (日) 16:56:47 - AA 手法としては、Cas9 RNPと目的のSNPを含む合成一本鎖DNAをエレポする、というのが効率が良いとされていると思います。 ご自身がどのくらいの効率を「ハイスループット」と考えられているかが問題かと思いますが、一般的にはシングルセル化したうちの1%程度がSNP導入なら十分「ハイスループット」かと思います。 SNPだけ導入した場合はゲノムを抽出して配列を読む必要がありますので、枚数分のプレートの培地交換やサンプルからのゲノム抽出、サンガーシークエンスを無理なくこなせる量をご自身で設定されたほうがいいでしょう。 一度にやるなら3変異くらい、という同僚の方のご意見に私も同意ですが、初めてやるなら1つからのほうがいいと思います。 ちなみにホモアリルで改変を入れたい場合は更に大変になります。

SNP挿入のゲノム編集実験に関しまして 削除/引用 No.10063-1 - 2021/11/22 (月) 22:35:43 - 名前？ 細胞株でWTの遺伝子に色々なSNPを挿入する実験を考えています． 初心者です． SNPを挿入した後，該当タンパクを抽出する予定ですが， （まだやったことがないのですが， CRISPRで同様のことをした先行術者によると） CRISPRでできるのはシングルセルで培養の手間も考えると せいぜい同時に行えて3種類くらいなのでは？とのことでした． ピンポイントのゲノム編集といいますか， 色々なSNP挿入細胞をハイスループットで作れたらいいと考えていますが， 素人すぎてどういう手法がいいのかまったく思いつきません． ご存知の方いらっしゃいましたら，ご教示くだされば幸いです．

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