ラット肝臓からfolch法により脂質を抽出し、酵素法(和光の「トリグリセライド E-テストワコー」使用)によりトリグリセリドとコレステロールを測定し、群間比較したいと考えています。
そこで、3点ご教授いただきたい事がございます。
@文献により少しずつ手法が異なるのですが、下記の手順で問題なく測定できますでしょうか。また、手順2の()内のような抽出時間は必要でしょうか。
A手順3にて遠心分離ではなく濾過する際、KClを添加する手法を拝見しましたが、どの程度重要な作業でしょうか。
A途中何処かの段階で保存することは可能でしょうか。一度に抽出し、測定はトリグリセリドとコレステロールを別日に分けて行うのが理想ですが、脂質の酸化や試薬の揮発等を考えるとどこで止めて良いのでしょうか。手順4後に石油エーテルに溶解し保存する方法を拝見しましたが、当ラボに石油エーテルはないようでした。
【手順】
1.チューブにラット肝臓約100mgを秤量する
2.1mLのメタノール:クロロホルム(1:2)でホモジナイズする
(数10分〜1時間振とう抽出)
3.遠心分離(15000g, 5分ほど)
4.400μLの下層を新しいチューブに移し, 窒素下で溶媒を完全に飛ばす
5.100µLの10% Triton-X100 in イソプロパノールで溶解する
6.キットのプロトコルに従い測定
長文大変失礼いたしました。ご存じの部分だけでもご教授いただけると幸いです。 |
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