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(無題) 削除/引用 No.10030-6 - 2021/11/13 (土) 19:22:17 - おお agilent社のマイクロアレイということなので、その遺伝子を検出したプローブの配列がわかるはず。遺伝子のその配列あたりをPCRのアンプリコンとすれば、マイクロアレイのバリデーションとして納得の行くデザインになると思います。 前に書いた発言とちょっと食い違っている部分もありますが、RNAseqなども考慮にいてた発言でしょたので。。。

(無題) 削除/引用 No.10030-5 - 2021/11/13 (土) 13:19:26 - PCR >>おおさま ご回答、また、非常に重要なご指摘ありがとうございます。 今回、ある遺伝子の機能やバリアント毎の違いに注目しているというより、最後に書かれているようにRNA seqで網羅的に解析した結果、ある刺激で発現が上昇している遺伝子のmRNAについてのvalidationを行なうためにqRT-PCRを計画しています。数が多いのとすべて信憑性の高い論文に記載されているわけではなかったため完全に自作しなければならないものがありましたので日頃の疑問も含め投稿した次第です。 一つプライマーを作成するといっても様々な目的があり、また、バリアントといっても蛋白の名前は同じでもそれぞれにいろんな機能や活性の違いがあったりすること、非常に勉強になりました。 agilent社のマイクロアレイ法で行なったものでtranscript variantは1つしか解析されていないものも多くそもそもtranscript variantが記載されていないものもありましたので、当初は特異性を上げてメインのバリアントのみを検出しようかとも思っていましたが、ご教授いただいたとおり、ある刺激に対するその遺伝子の転写活性をみることが重要（蛋白をみているわけではない）であることから様々なvariantを含むような配列でまずは確認してみようと思います。

(無題) 削除/引用 No.10030-4 - 2021/11/13 (土) 10:21:45 - おお ほんとにその遺伝子の機能など研究していくんだったら、どんなバリアントが検出されていてバリアントの機能はにそれぞれどのようなことがわかっていて、配列から（タンパクなら）どんなドメインがあって、あるいはなくてその結果からどんな機能が予測できてなど一揃え調べて、必要があればバリアント特異的なものなど考慮にいれた複数のプライマーセットを作ることも考えるべきです。qRT PCRであればバリアントにより違うサイズのPCR productsができるとノンスペ なのかバリアントなのかという上で話がややこしくなると思いますが、電気泳動で検出することを考えているのなら別です。 まあ結局のところはPREDICTEDで存在を実証されてないものと同様にわかっていることを基準に見ていくしかないでしょうけど。 遺伝子の発現を見たいと言うのはずいぶん大雑把な言い方で、上記のことについて無関心な状態ですると言うことのなってしまうわけですが、かと言っても色々研究の進め方があるだろうから否定するつもりはありません。昔のNorthern blottingでも１００bぐらいの違いを見ろと言うのは無理で、それでも発現量を見るのに使われていましたし。網羅的解析の裏とりなら（注目しているバリアントがない限り）、なるべくValidationできているTranscriptsすべてをカバーできうるものがいいと思います。その遺伝子をTranscriptionする活性に注目しているときも大体そうです（ただしTranscriptional start siteがによる違いを見るならそうとまで言えません）。

(無題) 削除/引用 No.10030-3 - 2021/11/13 (土) 09:07:04 - PCR >>おおさま 質問�Bに対するお返事ありがとうございます。不勉強で英語のニュアンスがわからない部分があるかもしれませんが、 実際にわかっているものではなくコンピュータで算出されたもの、ということであまりプライマー作成時に意識する必要はないという理解でよろしいのでしょうか？ なお、補足ですが、今回プライマー作成の目的としてはある細胞、臓器におけるある遺伝子の発現量をみるためのものです。 なるべくその遺伝子のみに特異的なもの、かつ臓器によっては発現量が少ない可能性があるので検出感度も高いもの、という相反する要望があるのですが、両者のバランスを考えたときにtranscript variantやその他の条件をどのように順位立てて考えたらよいか、ということで質問いたしました。

(無題) 削除/引用 No.10030-2 - 2021/11/13 (土) 03:44:51 - おお What is the difference between XM_ and NM_ accessions? Accession numbers that begin with the prefix XM_ (mRNA), XR_ (non-coding RNA), and XP_ (protein) are model RefSeqs produced either by NCBI’s genome annotation pipeline or copied from computationally annotated submissions to the INSDC. These RefSeq records are derived from the genome sequence and have varying levels of transcript or protein homology support. They represent the predicted transcripts and proteins annotated on the NCBI RefSeq contigs and may differ from INSDC mRNA submissions or from the subsequently curated RefSeq records (with NM_, NR_, or NP_ accession prefixes). These differences may reflect real sequence variation (polymorphism), or errors or gaps in the available genome sequence. The support for model RefSeq records should be further evaluated by comparing them to other sequence information available in Gene, Related Sequences, and BLAST reports. The genome annotation pipelines are automated and their predicted products may or may not be subject to manual curation, but the data may be refreshed periodically. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK50679/#RefSeqFAQ.what_is_the_difference_between

トランスクリプトバリアントについて 削除/引用 No.10030-1 - 2021/11/12 (金) 04:43:25 - PCR 長文・質問が多岐にわたり申し訳ございません。mRNAのトランスクリプトバリアントについて3つの質問をさせていただきます。 �@RT-PCRを行なうにあたりプライマーをprimer blastなどで自分で作成する際、transcript variantはどのくらい意識したらよいでしょうか。自作の際の優先順位なども含めご教授ください。 論文に記載されているプライマー配列を検索にかけると相補性や長さ、exon-exon junctionなどよりtranscript variantをより含むような設計となっていたりします。 論文のものを引用することが多いのですが自作する場合特異性やダイマー形成などを避けることを優先しvariantの検出はあまり意識してきませんでした。 �A確かにタカラバイオなどの委託サイトでもvariant率を表示したりしていますので、やはりメジャーなバリアントは含むように設計すべきかな、と思い直しています。たとえばvariant1, 2, 3・・・で発現量に差がある場合は意識した方がよいように思います。ただそれぞれのvariantの発現量の差を調べる方法があれば最も多いものを優先して含むようにするなど対処法があるように思います。そういった方法がありますでしょうか。 �BNCBIで検索した際に出てくる'PREDICTED' transcript variantX1, X2, というvariantはどういった意味合いがあるのでしょうか。よくわかっていない、メジャーではない、発現量の少ないvariantということでこれはあまり意識しなくてよいでしょうか。 よろしくお願いいたします。

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