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(無題) 削除/引用 No.10024-9 - 2021/11/16 (火) 04:28:45 - こ895 これを購入して、付属のマニュアルに沿ってincubationすればできると信じています。 どなかたご親切な方是非を教えていただけませんか？ Gpr84 Mouse siRNA Oligo Duplex (Locus ID 80910)

(無題) 削除/引用 No.10024-8 - 2021/11/16 (火) 03:43:19 - おお CRISPRを用いたノックアウトの場合シングルクローンを単離してKOされている細胞を探さないといけないですからね。そういう準備作業で２ヶ月ぐらいかかるかも。

(無題) 削除/引用 No.10024-7 - 2021/11/16 (火) 02:06:45 - おぉ GPCRをターゲットにする場合、siRNAやshRNAなどによるノックダウンより、CRISPRを用いたノックアウトの方が効果はあるかと思います。 なぜなのでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.10024-6 - 2021/11/12 (金) 23:15:32 - PYK C2C12は使用したことはありませんが、遺伝子導入がPEIやLipifectamine2000などで可能であるなら、比較的簡単にノックアウト細胞ができます。 「C2C12細胞」「CRISPR」で検索してかなりの数ヒットすれば、可能でしょう。

(無題) 削除/引用 No.10024-5 - 2021/11/12 (金) 22:34:41 - こ895 CRISPRと聞くと最先端の技術のように聞こえるのですが、簡易に購入できる試薬と一緒に細胞をincubationするという理解で良いですか？ 細胞はC2C12 (骨格筋として)やHL-1 (心筋として)のような汎用的なものを予定しています。

(無題) 削除/引用 No.10024-4 - 2021/11/12 (金) 22:21:48 - PYK 目的にもよるかと思いますが、GPCRをターゲットにする場合、siRNAやshRNAなどによるノックダウンより、CRISPRを用いたノックアウトの方が効果はあるかと思います。用いるセルラインにもよりますが、遺伝子導入効率がそれなりに良い場合、pX459などのプラスミドを用意するだけで、ノックアウト細胞が比較的簡単にできます。

(無題) 削除/引用 No.10024-3 - 2021/11/12 (金) 20:59:15 - こ895 詳細をありがとうございます。 少し理解するのに時間がかかってしまいました。。。 当ラボは施設的に整ったラボではございません。この程度の質問をしているレベルです。大腸菌や感染などの言葉とは無縁です。 その点を踏まえるとRNAi とsiRNA Oligo Duplexesが良く以下の２点を購入し、細胞と一緒にincubationするというイメージ(詳細は購入時の説明書に沿って？)でよろしいでしょうか？ 購入試薬 1) RNAi or siRNA Oligo Duplexes 2) siRNA用Transfection試薬（リポフェくたミンなど)

(無題) 削除/引用 No.10024-2 - 2021/11/09 (火) 05:52:30 - おお RNAi とsiRNA Oligo Duplexes は合成されたRNAで、siRNAようTransfection試薬（リポフェくたミンのたぐいとか）があれば導入できます（昔はDNA用のものを使っていてよく入る細胞ならそれでもうまくいくはずです）。発現はTransient（導入して安定導入株は得られません）。 shRNA Plasmids はもしかしたらLenti作成用と普通の発現ベクターがあると思います。両者とも基本的にTransfection用試薬で導入してTransient やStableで使用可能ですが、私の知り合いの経験ではどうもshRNAのInverted repeatの部分があまり安定でないのか安定株は全滅でした（複数の遺伝子で）。プラスミドですので必要に応じて大腸菌に導入してプラスミドを調製することができますので、一度購入して使い切っても買い足す必要はない（自身のラボでプラスミド抽出できるなら）です。 上記の２種類はエレクトロポレーションでもいいかと思います shRNA Lentiviral Particlesはレンチウイルスのゲノムの一部をshRNAに入れ換えたもので、それを感染して安定導入株を作るものです。私の手ではよくワークしています。試薬としてはポリブレンなど感染増強で使われるようなものが必要かもしれません（なくてどの程度導入できるかはわかりません）。ただし感染するものを使うわけですから必要なBiosafety levelの施設、設備で廃液等も必要な処理をちゃんとすることが前提です。

shRNAに必要な物資、操作 削除/引用 No.10024-1 - 2021/11/09 (火) 04:12:39 - こ895 shRNAに必要な物資、操作を教えていただけないでしょうか？ 当方、shRNA初心者です。 cell lineにGPR120の発現を抑制しようと思い、shRNAの使用を考えています。 ORIGENEにて購入を考えているのですが、購入候補がいくつかあるため、どれを選べば良いか理解ができません。URLが貼れないのですが、ORIGENEのページにてGPR120と検索すると以下のような表示になります。 RNAi (14) shRNA Plasmids (8) shRNA Lentiviral Particles (3) siRNA Oligo Duplexes (3) どなた様かご助言いただけないでしょうか？ 併せて操作やコツ、別途必要な試薬なども教えていただけると幸いです。

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