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(無題) 削除/引用 No.10022-5 - 2021/11/08 (月) 16:52:28 - AA cDNA合成のときに使われるランダムプライマーはヘキサマーなので伸長反応のプライミングには問題ないかもしれません。 ただ、9merしかないとTmがかなり低くなると思うのでPCRとしてはうまく行かなそうなきがします。 最近は1mer=10-20円くらいですし、作り直しても数百円しか変わらないですから、そこをケチって浮くお金と作業がドツボにはまって無駄になる時間を天秤にかけて、私なら作り直します。

(無題) 削除/引用 No.10022-4 - 2021/11/08 (月) 15:20:38 - G25 ・そのPCR産物をリン酸化してライゲーションで重合化してから制限酵素消化します。制限酵素サイトが末端ではなくなりますので切ることができるよういなります。 ・いっそのこと、制限酵素サイト関係なしにプラスミドにblunt-end ligationしちまいます。一旦、ベクターにクローニングしてしまえば、DNA末端じゃなくなりますので問題なく制限酵素で切れるようになります。blunt-end ligationは効率が低いとは言うけれど、実用に耐えないということはない。 わざわざ制限酵素サイトつけた意味ないじゃんか、と思うかもしれませんが、結構、やってる人、居るみたいです。 末端に余剰ヌクレオチドの足場をつけても、プライマーに設計した制限酵素サイトはしばしば、切断効率が低くて上手くいかぬことがあります。directional cloningのため両末端にそれぞれ制限酵素サイトをつけるとかしてPCRしたんだけれど、それを直接切ってライゲーションするのがどうも上手くいかない、ってとき、いったんblunt-end cloningしてできたプラスミドから設計した制限酵素サイトで切り出すなんてケースです。

(無題) 削除/引用 No.10022-3 - 2021/11/08 (月) 13:18:09 - noname そんなことをするくらいなら新しく作り直したほうが早いし、結局安く済むと思います。

(無題) 削除/引用 No.10022-2 - 2021/11/08 (月) 13:10:27 - seventh 2回PCRかけるぐらいなら買い直したほうが楽でトータルコストも下がるのでは。 足場は長くても良いのでアニーリングの温度とかを調整すれば出来なくもないでしょうけど。

プライマーの最低文字数 削除/引用 No.10022-1 - 2021/11/08 (月) 12:49:41 - 山田 ゲノムから特定の領域を切り出し、それをプラスミドに組み込もうとして、いくつかの標的領域(約1000bp)の前後に制限酵素サイト(BamHIとXhoI)をくっつけたプライマー(標的29bp+制限酵素サイト6bp)を設計しました。しかし、恥ずかしながら末端の直近は制限酵素で切断できないということを知らず、直に制限酵素サイトのみをくっつけたプライマーを設計してしまいました。しかし、全ての領域に対してプライマーを作り直すのはもったいない気がします。そこで制限酵素サイト6文字+足場(?)3文字をくっつけた共通のプライマーを作って、足場がついていないフラグメントを鋳型にして増幅し、目指す大きさのものを切り出して来れないかと考えました。しかし、そんな短いプライマーではちゃんと増幅できないか、関係ないフラグメントが大量にできてしまうでしょうか？ ポリメラーゼはKOD+を使っています

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