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(無題) 削除/引用 No.10018-14 - 2021/11/08 (月) 18:30:04 - おお 細胞に入るDNAの調整ですが、リポフェくたミンなどの試薬では難しいかもしれませんが、調整しやすい方法としてエレクトロポレーションがあります。実際ESでホモろがスリコンビネーションなど過剰なDNAが入ってほしくない場合よく使われると思います。まあそれでも入ってない細胞もDNA量を減らすと出てくる可能性は否定できませんが、切れの良い薬剤マーカーなら低濃度で一日培養すると導入されたものがエンリッチメントされます。TransientのTransfectionでどうしても導入されてない細胞を除外したいとき使われる事があります。

ありがとうございます 削除/引用 No.10018-13 - 2021/11/08 (月) 18:13:50 - mari mp様、T-2様、ご助言を下さり、有難うございます。 ご指摘の通り、実際の細胞に導入されるプラスミド数は不均一である可能性が高く、それによって結果の解釈や再現性に問題が生じる事になる可能性を、私自身も危惧しております。 まずは、お金と手間のかからない方法（トランスフェクトするDNAの量を調整）でやってみようかと思って準備を進めておりますが、「急がば廻れ」ということもきちんと念頭において、あまりそこの条件検討に拘りすぎないで、早めにプロモーター組み換えへの変更や、薬剤濃度で調整する方法、合成したmRNA合成をトランスフェクトする方法など、こちらでご指導頂いた方法を試してみたいと存じます。 皆様からのアドバイスが、本当に参考になります。重ねて御礼申し上げます。

(無題) 削除/引用 No.10018-12 - 2021/11/08 (月) 13:54:14 - mp T-2さんのおっしゃる通り、一過性発現でDNA量をいじって発現量を調整するのはかなり難しいと思う。 レトロかレンチで弱いプロモーターを使うのが近道と思います。

(無題) 削除/引用 No.10018-11 - 2021/11/08 (月) 12:21:15 - T-2 DNAを減らした場合、1細胞あたりに導入されるコピー数が 少なくなると期待されますが、一方で導入される細胞数が減る可能性は ありませんか？例えばGFP発現ベクターのDNA量を振って導入すると DNA量が減るに従って検出されるGFP陽性細胞数は減ると思います。 ウェル全体で見れば発現量は減っているように見えるかもしれませんが、 個々の細胞を見れば発現が高かったり、 低かったりしている可能性があると思います。 DNAを減らして観察したい現象が追えれば良いですが、 間違った解釈になるかもしれません。

ありがとうございます 削除/引用 No.10018-10 - 2021/11/08 (月) 12:00:01 - mari Tracker様、おお様、大変参考になるアドバイスを有難うございます。 知らない事ばかりでお恥ずかしいのですが、お二方から頂きましたアドバイスを参考に、少しずつ勉強し、実験を重ねて参ります。

(無題) 削除/引用 No.10018-9 - 2021/11/06 (土) 05:29:40 - おお 済になっていますが、アイデア（単なるアイデアの段階）などをいくらか上げておきます。 もしかしたらmRNAを合成してトランスフェクションした方が発現量をコントロールし易いかもしれません。発現量調整はプラスミドと一緒でキャリアーRNAかDNAを混ぜて全体でほぼ同じ量にして、比を変えればいいでしょうから。 まあそういう意味ではmRNAをトランスフェクションした経験のある人のコメントがあるとより理解が深まるかなと思います。 タンパクを精製してタンパク細胞に導入するテクニックもありますがこれについてはどうなるか想像も付きません。 プロモーターの入れ替えなどについてですが、昔cDNAのORFにプロモーターとPolyA siteをPCRをしながら付加してそのPCRプロダクトを直接細胞に導入するという手法が商品として紹介されていたのを思い出しました。PCRでタグDNA配列を付加していくので自前で設計できるだろうしうまくやれば新しいConstructionを作り直すより手軽にできるかもしれません。ただまあPCRプロダクツなので変異が入ったものも多くはないけどできて、そういうのが混合したものを導入していると考えるべきでしょう。 Tet/Dox誘導やSingleクローンで低発現を探すのは昔からある常套手段ではあります。

(無題) 削除/引用 No.10018-8 - 2021/11/05 (金) 21:17:07 - Tracker Dox-onとかも良いのでは？ 目的の発現レベルになるようなDox濃度を探すか、あるいはDox非存在下のleakyな発現でちょうどよいレベルになるかもしれない。 ただ、数十倍 vs 20万倍で、タンパク質としての発現にどれくらい効いているかは気にされた方が良いと思います。 発現量を気にするなら、自分ならAIDタグのような自己分解の系を使います。

ありがとうございます 削除/引用 No.10018-7 - 2021/11/05 (金) 15:17:26 - mari TS様、ご助言下さり有難うございます。 ＞思い付きですが、トランスフェクション効率の悪い試薬や方法を用いるとかは。トランスフェクションの時間を短くするとか。 これまで導入効率の良い方法や細胞株を探す事が多かったのですが、あえて、導入効率の悪い細胞株を使ってみるのもトライする価値があるかも、と思えて参りました。トランスフェクションの時間も、神経系の細胞なので元々短時間を心掛けてきましたが、さらに短くする事も試したいと存じます。 これまで皆様から頂いた助言をまとめますと、 �@プラスミドを薄い濃度（空プラスミドと混ぜて、DNA総量としては常識的な添加量とする） �A暴露時間は短時間 �B導入効率の悪い試薬や細胞株 �C細胞が傷まないよう留意しつつ、1回位継代してから回収 �Dそれでもダメならばプロモーターを組み替える �E発現量の少ない安定細胞株の樹立を試みる �@〜�Cはすぐにでも取り掛かれそうですので、まずは色々とやってみます。皆様、どうも有難うございました。今後とも何卒宜しくお願い申し上げます。

(無題) 削除/引用 No.10018-6 - 2021/11/05 (金) 14:48:44 - TS 思い付きですが、トランスフェクション効率の悪い試薬や方法を用いるとかは。 トランスフェクションの時間を短くするとか。 20万倍から数倍まで再現よく落とすのは難しいかな。

ありがとうございます 削除/引用 No.10018-5 - 2021/11/05 (金) 14:09:41 - mari おお様、いつもご助言下さり有難うございます。 また、プロモーターに関する論文をご紹介下さり、有難うございました。 現在、ヒトの悪性神経膠腫培養細胞にリポフェクタミンを用いて一過性トランスフェクションを行っています。再現性の有無が最も大切だと常々感じておりますので、予備実験を重ねて条件を検討したいと存じます。 全ての細胞に、均等かつ薄い濃度で強制発現ベクターがトランスフェクトされる事が理想的なのですが、生き物が相手なので、そこは仕方ないと腹をくくって、頑張ります！

(無題) 削除/引用 No.10018-4 - 2021/11/05 (金) 13:16:59 - おお https://journals.plos.org/plosone/article?id=10.1371/journal.pone.0010611 ほんとに効率がよくTransient transfection ができるなら、１２WellぐらいでTransfectionして、１０cmに巻き直してセレクション抜きで増殖させたら発現レベルも落ちてくるのでは？と無責任にいってみる。

ありがとうございます 削除/引用 No.10018-3 - 2021/11/05 (金) 10:48:16 - mari G25様、ご助言下さりありがとうございます。 以前、抗生剤でセレクションをかけて作成した強制発現細胞株でも、強烈な強制発現が掛かっていました。しかし、ご指摘の通り、程よい発現量を示す株をピックアップする事は実施しておりませんでした。 こちらにご相談した後、古いトピックを見つけました。 G25様から頂いたアドバイスに加えて、こちらも参考にしたいと存じます。 http://www.kenkyuu2.net/cgi-biotech2012/biotechforum.cgi?mode=view;Code=5541 引き続き、ご意見を賜れれば幸いです。

(無題) 削除/引用 No.10018-2 - 2021/11/05 (金) 10:24:27 - G25 一過的トランスフェクションでなく、継代を重ねて安定株を取る。 ゲノムにインテグレートするベクターの数も単一ではないだろうけど、数の少ない適度な発現をする株をとる。これなら再現性の問題もクリアできるのでは。

少しだけ強制発現したい時はどうすればよいですか？ 削除/引用 No.10018-1 - 2021/11/05 (金) 09:41:08 - mari 目的遺伝子を少しだけ強制発現したい時どのような方法があるのか、どなたかご教示をお願い申し上げます。 現在、研究室で使っているプラスミドベクターを用いて、培養細胞に対し一過性の標的遺伝子強制発現を行っています。そのプラスミドは、CMVプロモーターが組み込まれており、mRNAレベルで20万倍近くの発現量上昇が得られます。しかし、そのような強烈な強制発現ではなく、数倍〜数十倍程度の、あるいは微増程度のデータが欲しいと考えております。 （これまで、細胞に添加するプラスミドの量を、極端に減らしてみたところ、少しは思い通りの発現増加が得られました。ただし、極端なだけに、再現性について疑問を呈されそうな気がします。） プロモータを乗せ換えるというご意見もあるかと存じますが、その際、お勧めのプロモーターがございましたら、そこについてもご教示頂ければ幸いと存じます。

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