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(無題) 削除/引用 No.10005-11 - 2021/10/29 (金) 15:13:10 - ema 以前Jurkat細胞にトランスフェクトして、クローン化したくて限界希釈法でシングルコロニーを拾っていました。 96Well丸底で、最初20％FBSで他は変更なし培地で、増えてきたら10％に戻していました。 普通に増えていました。

シングルセルの単離 削除/引用 No.10005-10 - 2021/10/29 (金) 08:16:37 - 細胞 Jurkat細胞を培養したことがないのですが、いろいろな細胞をクローニングしていました。 長い間培養していると、同じ細胞株でも弱い細胞と強い細胞が出来てきます。 まずは96ウエルプレートで1ウエル当たり5-10個くらいで培養して、グロースが良さそうなウエルから細胞をピックアップして、だんだん細胞を強くしてはどうですか？ 他の人が書いておられるように、液量を多くしないこと、コンディショニングメディウムを使うことは良いようです。 どうぞご参考になさってください。

(無題) 削除/引用 No.10005-9 - 2021/10/29 (金) 02:47:08 - おお >X線かγ線の照射設備が利用可能ならフィーダー細胞を準備するのがおすすめ。 マイトマイシンなどで増殖をとめて使うという方法もありましたよね。あまり良くないのかな。

(無題) 削除/引用 No.10005-8 - 2021/10/28 (木) 11:35:49 - G25 X線かγ線の照射設備が利用可能ならフィーダー細胞を準備するのがおすすめ。 γ線は学内共用施設のような大規模なところにしかなくて気後れするかもしれないけれど、X線照射装置は、研究室でもってい気軽に使っているところも少なくないと思うので、ご近所をあたってみる。

(無題) 削除/引用 No.10005-7 - 2021/10/28 (木) 11:29:53 - toto たぶん培養条件はあまり変えたくないのですよね。sさんのいわれるように、私も血清を他のに代えてみて、濃度を20％に上げる、非動化してるのであればしないで使ってみる、あるいは逆、ということくらいでしょうか。血清のロットが一番影響すると思います。

(無題) 削除/引用 No.10005-6 - 2021/10/28 (木) 09:44:39 - 774 似たような実験をやることがありまして、培養開始時の培地の量が少ない方が生存率が高いように感じます。 蒸発しやすくなるので要注意です。 少なめの50−100ulで培養を始めて、１週間後に少し足す。くらいでしょうか。 どれくらいの規模でクローニングしているかによりますが、 プレート1枚くらいなら、それほど手間でもないかなと思います。 大規模でやるんだったらできるだけ多く入れて、数で勝負します。

(無題) 削除/引用 No.10005-5 - 2021/10/28 (木) 09:11:31 - さく 横からですが、参考になります。 conditioned mediumが浮かびますが、個人的にはこれで劇的に良くなった！という経験がないんですよね…。印象的には100%死んでたのが95%ぐらい死ぬぐらいになった、という感じです。播種数で頑張りました。 あと、私ならペニシリンストレプトマイシンを抜いてみるところもやってみます。

(無題) 削除/引用 No.10005-4 - 2021/10/28 (木) 02:35:28 - おお わたしもconditioned mediumが真っ先に浮かびます。 これ、浮遊細胞ですよね。マトリジェルとかでもある程度効果があるかもしれません。Dish表面になにかコートするてもあるかもしれませんが、何がいいのかよくわかりませんね。あとは血清の量を少し上げてみるとかできるかもしれませんが保証の限りではないです。 ９６穴は平底ですか。丸底ですか？限界希釈が丸底で対応できるなら、そちらのほうが気持ちの問題程度かもしれないけど丸底のほうがいいかもしれない。細胞が中心に貯まるのでconditioned mediumと同じような効果がいくらかは期待できるという話もあるから。 最近では細胞死を抑える試薬としてY-27632（RHO/ROCK pathway inhibitor）がよく使われています。 Enhances survival of human embryonic stem (ES) cells when they are dissociated to single cells by preventing dissociation-induced apoptosis (anoikis), thus increasing their cloning efficiency (Watanabe et al.). https://www.stemcell.com/y-27632.html 上記はESについて言及してますが、一つの細胞からorganoidを形成させるようなときも使われたりするようです。

(無題) 削除/引用 No.10005-3 - 2021/10/27 (水) 19:30:10 - G25 フィーダー細胞を使う。 conditioned mediumを使う。

(無題) 削除/引用 No.10005-2 - 2021/10/27 (水) 19:14:09 - s FBSを新しいロットに変えたらクローニング効率が10倍以上あがるというのを最近体験しました。元のFBSは使用期限を少し過ぎていたのですが、普通に実験のために継代している限りでは全然気がつきませんでした。 Dishあたり100個ぐらいまいてコロニーフォーメーションした時のコロニー数の差はせいぜい2倍ぐらいだったので、ごく少数の細胞から増やす時に効いてくるようです。

シングルセル単離→培養が出来ません。 削除/引用 No.10005-1 - 2021/10/27 (水) 18:57:32 - J とある事情によりJurkat細胞を96ウェルプレートにシングルセル単離し、培養、増殖させることを試みています。 Serial dilutionにより1 well ずつにシングルセル単離はできるのですが、 細胞１匹ですと数日後死んでしまい増殖させることができません。 どなたか良い培養方法をご存じでしょうか？ 現在の培養液は通常のRPMI+FBS+ペニシリン・ストレプトマイシンです。 培養液に追加の栄養素を加えたり、あるいは96well ではなく384wellの方が培養に良かったりするのでしょうか？ ご意見を頂戴出来ますと幸いです。

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