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(無題) 削除/引用 No.10-6 - 2012/01/07 (土) 17:18:30 - mon > 培養細胞で、目的遺伝子を発現している細胞と発現していない細胞をフローサイトによって分離して研究に用いたい という目的で、レポーター遺伝子の一過性遺伝子導入を用いる方法は簡便ですが皆さんが言われているような制限・欠点が避けられません。もちろん、それでもうまく行く可能性もあります。 理想的には以下の方法が考えられますし、報告もありますね。 (1)Oct4遺伝子等で行われているように、ゲノム上の目的遺伝子の最終エキソンにIRES-GFPを挿入する（knock-in)する方法。 (2)ゲノム上の制御配列（+エキソン）すべてが載ったBACが運良く入手可能であれば、さらにそれにIRES-GFPを挿入した改変BACを作製し、そのBACを導入した細胞を使用する方法があります。BACサイズになると染色体外で複製され遺伝子発現も内在性遺伝子と同様に制御されるようです。 細胞・ゲノムDNAの扱いの慣れにもよりますが、培養細胞なら(1)の方が容易かなと思います。

(無題) 削除/引用 No.10-5 - 2012/01/07 (土) 11:08:12 - Harmonia 何の遺伝子か、って言ったらまずいのでしょうか？ 議論が少なくとも２点に分かれます。 １．ベクター構築の設計、方法をどうするか。 ２．ベクターが出来上がったとして、それをあなたの実験に使っていいのか？ ２は、ベクターの細胞への導入効率が論点で、 　2a 100％とはならないので、導入されて無い細胞が（実際には内在遺伝子が発現していても)「発現していない細胞」に分類されてしまう。 　2b 100％導入を実現するために、ベクターを持った細胞を薬剤耐性で選別して樹立できたとして、株化を進めるうちに細胞の特性が変化していないか？ 　2c 前項が（どういう方法かわからんが）クリアできたとして、内在遺伝子が発現していない細胞が、導入遺伝子を発現していない保証があるか（レポーターには漏れ発現がつきものなので、発現レベルの明らかな○×が期待できないから、どのレベルで○と×の線引きをするのか）。 そして 　2d そもそも内在性のタンパク質の存在をレポーター遺伝子の発光がレポートしているという実験データは得ることが可能なのか？（目的遺伝子の検出のための手持ちの検出方法と「レポーターってこういう風に光るんだ」という想像とを照らし合わせて検討してください。） １は、端的には、プロメガのエンハンサー研究用のベクターの構成を真似ればいいと思います。ただしminimum promoterがtkでいいのか他に何かあるか、イントロンを入れるかどうか、エンハンサーを前に入れるか後ろに入れるか、向きを成果逆かなど、考えるべき点は有るし、でもやって見ないと分からない側面もあります。すでにルシフェラーゼで誰かやっているなら、ルシフェラーゼのcdsをGFPのcdsに載せかえればいいでしょう。

回答ありがとうございます 削除/引用 No.10-4 - 2012/01/06 (金) 20:48:00 - sima 目的遺伝子は、レポーターアッセイの報告が多数あり、Enhancerの配列を用いている報告が多です。 培養細胞で、目的遺伝子を発現している細胞と発現していない細胞をフローサイトによって分離して研究に用いたいのですが、細胞質内タンパク質であるため、細胞を生きたまま抗体で染色してフローサイトで分離することができず、レポーターベクターがいいのではないかと考えています。 市販のベクターもあるのですが、GFPでなかったり、ウイルスベクターだったりで、用いることができず、また別のベクターを購入して移しかえるといったことをできる知識がないため、業者に配列を指定して、作ってもらう予定ですが、設計段階でつまずいています。 また、周りの人には尋ねていますが、なかなか答えが得られない環境ですので、こちらでも質問させていただいています。 文献を読んだところ、ベクターのmulticloning site内には、目的遺伝子のEnhancerの遺伝子配列の次に、herpes virus thymidine kinase promoterを入れて、その後にルシフェラーゼあるいはGFP遺伝子配列が入っています。これらのそれぞれの配列を直接くっつけたままで設計してベクターに組み込んでしまっていいのでしょうか。 positive controlとしてはherpes virus thymidine kinase promoterとルシフェラーゼあるいはGFP遺伝子配列を入れたものを使うのでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.10-3 - 2012/01/06 (金) 20:17:51 - Harmonia > 目的遺伝子のプロモーター部位、およびエンハンサー部位の配列、それぞれについてレポーターアッセイを行っている論文があるのですが、どちらを用いればよいのでしょうか。 プロモーターもエンハンサーも、そういう機能を持つ領域、ということですから、誰かが定義済みの塩基配列を使うのでなければ、興味を持った人が、「ここからここまではプロモーターとして機能してました」とか「エンハンサーでした」とか、これから調べて初めてわかるものです。 定義済みの塩基配列を使うとしても、あなたが見たいと思っている現象が、プロモーターを使うべきかエンハンサーを使うべきか、あるいは組み合わせて見るべきか、私には分かりません。それを判定するキーワードが提示されていないからです。 まずは、あなたが見たいと思っていることはナニで、それを見るための道具はナニが適切なのかを考え直すところからはじめるといいと思います。見たい現象によって、ルシフェラーゼが適当かGFPが適当か、ルシフェラーゼにしてもGFPにしても、産物が安定なものにするのかPESTが入った壊れやすいものにするのか、選択肢が変わってきます。 本や論文もいいですが、疑問を対話形式でぶつけることができる相手を見つけた方がいいような気がします。

(無題) 削除/引用 No.10-2 - 2012/01/06 (金) 15:59:43 - ~ レポーターアッセイに落としこめるほど転写制御についての報告のある遺伝子なのでしょうか？ それとも、これからその遺伝子の転写制御について解析されるのでしょうか？ >どちらを用いればよいのでしょうか。 対象となる遺伝子の転写の制御に必要な部位を使用する必要があるでしょう。 予備検討で、endoの遺伝子と同じように発現が制御されていることを確認して初めて、レポーターアッセイで使用しているGFPの蛍光量が、endoの遺伝子の発現量を反映しているということができます。 どの配列が転写（制御）に必要であるかがわからないのであれば、プロモーターの長さも含めて検討が必要でしょう。 エンハンサーの制御を受けているのであれば、転写開始点から数十kb以上離れている配列が転写に関与している場合もあります。 >よい本や文献などについて については、既に読まれている >それぞれについてレポーターアッセイを行っている論文 が十分参考に出来ると思いますが。 なぜプロモーター部位とエンハンサー部位について調べているのかや、ポジコン、ネガコンについても書かれていますよね。 ポジコン例： その系で発現することが判明しているベクター 例：恒常的に発現するプロモーターを含むベクター 　　ある処理をした場合に発現量が変動することが判明しているベクター ネガコン例： その系で発現しないことが判明しているベクター 例：プロモーターを含まないベクター 　　何らかの処理をしても、発現量が変動しないことが判明しているベクター

レポーターアッセイについて 削除/引用 No.10-1 - 2012/01/06 (金) 14:35:57 - sima Promegaなどで市販されているベクターや論文報告されているベクターでは、実験の目的に合わないため、自分でベクターの設計をする必要があり、分からないことだらけで困っています。 ある特定の遺伝子の発現の有無をレポーターアッセイでみたいと考えています。 目的遺伝子のプロモーター部位、およびエンハンサー部位の配列、それぞれについてレポーターアッセイを行っている論文があるのですが、どちらを用いればよいのでしょうか。 また、よくレポーターアッセイに用いられているルシフェラーゼではなく、GFP等の蛍光タンパク質の発現で解析したいのですが、目的遺伝子のプロモーターあるいはエンハンサー配列の下流にGFPの配列をつけて設計すればよいのでしょうか。 positive control, negative controlにどのようなベクターを用意すればよいのかもよく分かりません。 遺伝子導入に用いるベクターはプラスミドでないと使用できない環境です。 ベクターは外注で作成してもらう予定ですが、業者に質問しても分からないといわれました。 よい本や文献などについて、お教えいただけないでしょうか。 どうぞよろしくお願いします。

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