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PCR効率 100%以上 トピック削除
No.449-TOPIC - 2011/05/26 (木) 22:02:54 - kuwa
real-time PCRを使用して、検量線を作成しているのですが、

PCR効率が100%以上になることがあります(100-120%程度)。

各DNA濃度でのCt値の誤差はほとんどなく正常だと思うのですが、

何が原因でPCR効率が100%を超えてしまうのかわかりません。

どなたかご存知の方がいらしたら、教えてください。

おねがいしまう。
 
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No.449-7 - 2011/05/30 (月) 03:18:35 - kuwa
返事が遅れてしまい申し訳ありませんでした。

>ab さん
いくつかのDNA抽出方法を使用して得た、DNAを使っています。PCR効率が確かに抽出方法に依存しているように思えます。逆にPCR効率から、どの抽出方法が良かったのか言えるような気もしてきました。何か、参考文献お持ちでしたら、教えてください。

>Boston-Pullman さん
過去の論文で、すでに、特異性が確認されているプライマーとプローブを使用しています。

>ンンノ さん
興味深い見解をありがとうございます。こちらも参考文献等を上げていただけると幸いです。

みなさんご意見ありがとうございます。

(無題) 削除/引用
No.449-6 - 2011/05/27 (金) 10:41:15 - ンンノ
濃度の低いDNA溶液は希釈過程でチューブやチップに吸着して、希釈率よりも
実際の濃度が低くなります。
これを標準点として使うと見かけ上100%を超えうると思います。

cDNA試料溶液ではcDNA合成反応液にPCR反応の阻害効果が若干ある
ので、持ち込み割合が多い試料ではCtが小さめにでることがあって、これも
見かけ上の増幅効率が100%を超える原因になります。

(無題) 削除/引用
No.449-5 - 2011/05/27 (金) 06:57:53 - Boston-Pullman
>[Re:3] kuwaさんは書きました :
> サイバーグリーンでなくて、プローブを使用しているので、melting tempがみれません。

特異性はどのようにして確認されていますか?PCR でも WB でも特異性の確認は一番先にするべきことです。それなしでは、得られたデータに関して何も議論できないと思います。

(無題) 削除/引用
No.449-4 - 2011/05/27 (金) 06:49:53 - ab
PCRを阻害する物質があると100%を越えるそうです。
理論的な事とかはよくわかりませんが、以前粗精製のDNAを使ったら150%を越えました。
ちなみに、検量線はきれいに描けます。

(無題) 削除/引用
No.449-3 - 2011/05/27 (金) 02:16:03 - kuwa
サイバーグリーンでなくて、プローブを使用しているので、melting tempがみれません。

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No.449-2 - 2011/05/27 (金) 01:21:07 - Boston-Pullman
非特異的なバンドが増幅されている感じがします。melting temp はちゃんと確認されたでしょうか?

PCR効率 100%以上 削除/引用
No.449-1 - 2011/05/26 (木) 22:02:54 - kuwa
real-time PCRを使用して、検量線を作成しているのですが、

PCR効率が100%以上になることがあります(100-120%程度)。

各DNA濃度でのCt値の誤差はほとんどなく正常だと思うのですが、

何が原因でPCR効率が100%を超えてしまうのかわかりません。

どなたかご存知の方がいらしたら、教えてください。

おねがいしまう。

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