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(無題) 削除/引用 No.988-8 - 2011/10/01 (土) 17:07:04 - ま ありがとうございます。いずれにしても見かけほど簡単な実験では無さそうですね。 もしも、ここで使われているこの方法を参考にしてみたら？というような論文やプロトコールなどをご教授頂けると有難いのですが。 何度も申し訳ございません。

(無題) 削除/引用 No.988-7 - 2011/09/30 (金) 21:50:49 - 個人的にお勧めしません 似たストラテジーをとったことがありますが、目的蛋白の断片がマスでかなりカバーできなければ、努力が無駄になります。 蛋白によりますが、私の場合、30％しかカバーできなかった(多くの蛋白でそんな感じのような、、、）ので、大事な部分がカバーできず、トラブルでした。マスの前にLCを使うなら、LCで大事な部分の断片が分取できなければいけません。

(無題) 削除/引用 No.988-6 - 2011/09/30 (金) 21:26:38 - 中年 キナーゼと基質が十分量精製できるなら、ごく一般的な実験方針だと思います。qqさんがお書きになっているように、MS解析に掛けるサンプルはストイキオメトリックにリン酸化されていることが理想的ですので、バンドシフトやRIを用いた定量などで確認しておいた方が良いでしょう。

精製したキナーゼ分子と基質蛋白によるリン酸化部位の決定　 削除/引用 No.988-5 - 2011/09/30 (金) 02:33:44 - ま なるほど。FLAG-tagなどで落として解析するということですね。是非試してみたいと思います。アドバイスありがとうございます。 両分子間の直接的な（他の分子をまず介さない）リン酸化部位を決定出来たら、という考えも少しありましたもので、両蛋白を精製してみたのですが。 あまり一般的な実験法ではないのでしょうかね？

(無題) 削除/引用 No.988-4 - 2011/09/29 (木) 21:53:25 - KY 逆に私はin vitroだと条件によってはなんでもかんでもリン酸化してしまうことがあるのではと心配します。 リン酸化部位の同定であれば、目的タンパク質の過剰発現細胞でもよいのでin vivoからリン酸化タンパク質を精製して、同定したほうが、生理的なリン酸化部位を同定できます。 その後、リン酸化部位の変異体をin vitroで用いて、直接のリン酸化であることを証明すればよいと思います。 キナーゼやタンパク濃度にもよると思いますが、in vitroだとなんでもリン酸化することがありますし、関係ないところをリン酸化したりする場合があります。たとえば、コントロールで入れていたMBPとかまでリン酸化がある程度起きていたり。

(無題) 削除/引用 No.988-3 - 2011/09/28 (水) 23:58:06 - ま 御返信ありがとうございます。 蛋白は、キナーゼ分子、基質分子ともに精製致しました。 マンガンを加える条件は、当該キナーゼと同じファミリーに属する別個キナーゼ分子に関する論文を参考にしております。 確かに、in vitro phosphorylationの実験によってリン酸化を受ける蛋白質の割合はかなり低いものである、という話は聞いたことがあります。 どの程度リン酸化されているのかをRIの取り込みの値から計算しておくべきである、ということですね。 他にも何かアドバイスがございましたら、よろしくお願い致します。

(無題) 削除/引用 No.988-2 - 2011/09/28 (水) 22:40:09 - qq 御指導できるものではありませんが、 ＞リコンビナント蛋白を大腸菌から精製することに成功しました。 これは、キナーゼですか、基質タンパクですか、両方ですか？ ＞マンガンを含むリン酸化バッファーの中で両者をインキュベートし、 この条件は、当該のキナーゼでリン酸化する標準的な条件であることが判っているのですね？細胞内ではMnはそれほど（殆ど）多くないのですが、幾つかのキナーゼは確かに、リン酸化を促進しますよね。 リン酸化部位を同定するときに、ほんの少ししかリン酸化されていないとかなりきついので、リン酸化の程度（基質一分子あたり何モル）を評価できると良いと思います。予め、RIを使った実験がある方が安心です。

精製したキナーゼ分子と基質蛋白によるリン酸化部位の決定　 削除/引用 No.988-1 - 2011/09/28 (水) 15:45:13 - ま いつもこのフォーラムにはお世話になっております。 現在、ある蛋白キナーゼとその基質分子との関係について研究しているのですが、ようやくリコンビナント蛋白を大腸菌から精製することに成功しました。 マンガンを含むリン酸化バッファーの中で両者をインキュベートし、基質蛋白のうちのどのアミノ酸残基がリン酸化を受けうるのかを質量分析によって決定したいと考えているのですが、具体的にはどのような手順を踏むとよろしいでしょうか？ お勧めのプロトコール、参考文献、解析を委託できる（安価な）会社などもご紹介頂けると幸いです。 当方、蛋白質の扱いや理論には疎く、専門家の知り合いもおりませんので、御指導頂けると有難く存じます。お忙しいところ誠に恐縮ですが、よろしくお願い致します。

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