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ありがとうございます 削除/引用 No.983-6 - 2011/09/28 (水) 16:28:24 - ＳＳ　 私の説明が不十分である中、皆様から多くのご助言を頂け非常に助かりました。 皆様のご意見を参考にさせて頂き、方針としては �@タンパクＡの各ドメインのみを強発現させ、内在性のタンパクＢを共沈させる �AタンパクＡのドメインを結合が確認できなくなるまで削る を試してみたいと思います。 実際に�Aに関してはさらにドメインを削ってみたところ、共沈されるタンパクＢのバンドはさらに薄くなりました。後は洗浄を強化してバンドが消失するか試してみたいと思います。 in vitro translationは同じ研究室の方に勧められて検討しておりましたが、当面は機能解析を優先して行いたいと思います。 実験を指導する人間が不在な中、独りで苦慮していたため皆様のご意見は励みになりました。 ありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.983-5 - 2011/09/28 (水) 11:45:05 - すっこり タンパクBも強制発現させているようですね。強制発現させたタンパクは非特異的にいろいろなタンパクとベタベタとくっついてしまうことがあります(量がたくさんあるが故に)。FLAG-mock, FLAG-A1, ...と発現させて結合してくる内在性のタンパクBを検出するという系はいかがでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.983-4 - 2011/09/28 (水) 08:12:24 - う ＞複数個所でAとBが結合していると考えるのはタンパクAの機能を考える上で無理があるように感じたため 結果を「どう考察するか？」という問題であり、 （その結果はひとつの結果であって、それはどうもできない） そのタンパク質が何であるのか等を全くわからない第三者からは 何も言えないのではないでしょうか。 実験を行なった者の考察の仕方の問題である、ということです。 ＞現在、次の手としてin vitro translationによる結合確認を行おうと考えています。 私は何を意図している実験なのかわかりません。 免疫沈降と同じような結果になったら、どう考察するのでしょうか？ 違う結果がでたら、どう考察するのでしょうか？ 結局、何が起こっているのか、労力に応じた結論を導きだせるとは思いません、あくまで個人的に。 私だったら、わけたドメインをさらに削ったタンパク質を作ってどこで結合が無くなるか見ると思います。 それぞれのドメインで検出される薄いバンド、濃いバンドが消えるときを見極めます そうしてわかった結合に関与する領域にどのような特徴があるのか、 削ったタンパク質すべてに結合するというのであれば、非特異の可能性も考えるでしょう。

(無題) 削除/引用 No.983-3 - 2011/09/27 (火) 22:44:30 - み 共沈だけでは何とも言えない気がします。 その他の情報（最低限：細胞内共局在、極論：機能的データ）が無いと・・・。 homogenizeして溶液中でベタベタ会合したのですか？？？って突っ込んじゃいます。

(無題) 削除/引用 No.983-2 - 2011/09/27 (火) 19:22:23 - 何でもオーケー >内在性の免疫共沈でも一応タンパクAとタンパクBの結合が確認されているのですが、 個人的には、これができていれば、何でもオーケーと思います（ネガコンありで）。 論文にするなら、もう一個くらいネガコンがほしいところですが、A-5としてくっつかない任意の短い領域をぶち込んでおけばいいでしょう。 非特異的結合の可能性があると思うなら、強い洗浄条件をトライしてみましょう。

免疫沈降の信頼性 削除/引用 No.983-1 - 2011/09/27 (火) 18:44:40 - SS いつも勉強させて頂いております。 免疫沈降の信頼性について皆様のご意見を聞かせて頂きたくトピックを作成しました。 あるタンパクAの結合タンパクをyeast two hybrid法によりスクリーニングした結果、候補タンパクBを同定しました。 そこで、哺乳細胞（CHO細胞）にFLAG-タンパクAとV5-タンパクBを強発現させて免疫共沈を行った結果、FLAG抗体による免疫沈降、V5抗体による免疫沈降の両者で結合を確認することができました。 タンパクAのどの部位がタンパクBと結合するかを調べるためにタンパクAをドメインA-1、ドメインA-2、ドメインA-3、ドメインA-4と分けて、それぞれのドメインについて先ほどと同様のタグをつけて免疫共沈を行いました。 FLAG抗体で免疫沈降を行い、V5抗体でブロットしたところ、以下のような結果になりました。 FLAG-mock　V5-タンパクB　→　バンドなし FLAG-A-1　 V5-タンパクB　→　薄いバンド FLAG-A-2　 V5-タンパクB　→　濃いバンド FLAG-A-3　 V5-タンパクB　→　薄いバンド FLAG-A-4　 V5-タンパクB　→　濃いバンド このような場合、タンパクAとタンパクBは複数個所で結合していると考えるのが妥当なのか、非特異的結合を強く疑うべきなのかご教授ください。 細胞株を用いた内在性の免疫共沈でも一応タンパクAとタンパクBの結合が確認されているのですが、複数個所でAとBが結合していると考えるのはタンパクAの機能を考える上で無理があるように感じたため質問させて頂きました。 現在、次の手としてin vitro translationによる結合確認を行おうと考えています。

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