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上澄中のIFN-γ測定方法 トピック削除
No.981-TOPIC - 2011/09/27 (火) 12:54:22 - まるまる
いつも参考にさせていただいています。
担癌マウスに治療を行なった時の免疫状態の変化について調べています。
脾細胞のみで4日間培養したときの上澄中のIFN-γをELISAで測定しましたが、全くIFN-γを産生していないものから大量に産生しているものまで、非常に個体差が大きくて困っています（治療・未治療にかかわらず）。
安定的にIFN-γを産生させる方法はないでしょうか？
Stimulatorを加えるとか、培養期間を長くするとか考えていますが、どうなんでしょうか？
ご教授よろしくお願いします。
　
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No.981-7 - 2011/10/21 (金) 19:18:21 - まるまる
コメントありがとうございます。
私も腫瘍細胞とともに培養する必要があるのでないかと思うのですが、論文をみてみると、腫瘍細胞を入れて上澄中のIFN-γを計測しているものが見当たらないんですよね。調べ方が悪いのかもしれませんが・・・

(無題) 削除/引用
No.981-6 - 2011/10/19 (水) 12:53:19 - TK-1
抗原なり、PMA+Ionomycinのような刺激を入れないでみるのは無理でしょうし、抗腫瘍免疫を見たいのであれば、腫瘍細胞を入れないと意味がない。

(無題) 削除/引用
No.981-5 - 2011/10/19 (水) 12:17:14 - まるまる
コメントありがとうございます。

１個体からの脾細胞では、well間であまりIFN-γの産生に差がでないのですが、全く分泌しない個体はどのwellも産生しないんです。
論文を調べてみると、脾細胞を培養して上澄中のIFN-γを測定しているものもあるのですが、エラーバーも小さく、私のように全く分泌されていない状態のものはないようなので、何か特別な方法があるのでないかと思ったのですが。放射線もしくはマイトマイシンC処理後の癌細胞と培養するなんて方法も考えているんですが。


確かに誘発剤を入れると、その個体で抗腫瘍免疫が上昇しているのとは言い切れないかもしれませんね。
私が行いたいのは、薬剤によって抗腫瘍免疫が上昇（抗腫瘍免疫の抑制が減少）しているのかを確かめたいのです。放射線もしくはマイトマイシンC処理後の癌細胞と培養するなんて方法も考えているんですが。


ちなみにｍRNAやIFNγの細胞内染色も今後行う予定です。

(無題) 削除/引用
No.981-4 - 2011/10/17 (月) 21:18:07 - HIH
その実験系で個体における免疫状態の変化を調べるのであれば、以下の方法を適宜検討するのがよいと思います。

@血清中のIgGサブクラス濃度

A所属リンパ節からCD4及びCD8T細胞を精製し、T：mRNA抽出⇒遺伝子発現解析
　U：PMA/ionomycin刺激後にIFNγの細胞内染色

B所属リンパ節からCD4及びCD8T細胞を精製し、CD3/CD28再刺激後にELISA。

です。

Bは厳密にvivoでの免疫状態を反映するわけではないですが、簡単にIFNγを産生誘導できると思います。

厳密には@とAの組み合わせで得られた結果を考察すべきだと思います。　

(無題) 削除/引用
No.981-3 - 2011/10/17 (月) 14:20:21 - ~
目的や優先順位がよく分からないのですが。

>安定的にIFN-γを産生させる方法はないでしょうか？
産生”させる”のが目的であれば、
IFNγ発現を誘導する薬剤を培地に添加してもいいのでしょうけれども、

>治療を行なった時の免疫状態の変化について調べています。
が目的であるのでしたら、意図的に発現誘導剤を入れるのは治療による変化を隠しませんか？

1個体から取った脾細胞を分けて、それぞれの4日後のIFNγを調べることで、発現量の差が個体による影響なのか、in vitroに持ってきてから差が生じるのかは分かりますよね？
それで、差が生じる部分を切り分けて、その原因を潰していくのがいいのではないでしょうか。

(無題) 削除/引用
No.981-2 - 2011/10/17 (月) 12:53:16 - けんた
培養にConAを加えて、刺激をいれてみればどうですか？

上澄中のIFN-γ測定方法 削除/引用
No.981-1 - 2011/09/27 (火) 12:54:22 - まるまる
いつも参考にさせていただいています。
担癌マウスに治療を行なった時の免疫状態の変化について調べています。
脾細胞のみで4日間培養したときの上澄中のIFN-γをELISAで測定しましたが、全くIFN-γを産生していないものから大量に産生しているものまで、非常に個体差が大きくて困っています（治療・未治療にかかわらず）。
安定的にIFN-γを産生させる方法はないでしょうか？
Stimulatorを加えるとか、培養期間を長くするとか考えていますが、どうなんでしょうか？
ご教授よろしくお願いします。
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