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(無題) 削除/引用 No.98-7 - 2011/03/04 (金) 11:03:33 - AP 全長にこだわることはないと思います。全長を2つか3つに分けて、それぞれ大腸菌で発現させればいいんじゃないでしょうか。 うまくいくと、ドメインを見分ける抗体が得られて、のちのち役に立つかもしれないし。 あるいは、全長をnativeな形でとって、3次構造特異的抗体をとるのを狙っているのでしょうか。それは、ほとんど期待できないと思いますが。

(無題) 削除/引用 No.98-6 - 2011/03/04 (金) 05:43:11 - おお たとえば大腸菌でも全長、N末半分。C末半分とかいくつかコンストラクト作っておいて発現効率がアクセプタブルなものを抗原としてつかうとかできると思いますが、、、ペプチドで作ろうとしてたわけだからフルに全長で作ることが重要でもなさそうですし。

(無題) 削除/引用 No.98-5 - 2011/03/04 (金) 03:01:33 - p 膜タンパク質か分泌されるのか、細胞内タンパク質なのかで違ってくると思いますが、分泌タンパク質なら取れて数mg/L位でしょうか。適当なタグをつけて、無血清で培養すれば結構きれいに精製できます。最近は、InvitrogenからFreeStyleが出てますが、金銭的に余裕があれば簡単でよいと思います。 膜タンパク質や細胞内タンパク質を哺乳動物細胞で大量に調製するには細胞自体を大量に集めなければならないので大変だと思います。 いずれにしても、タンパク質の構造を認識する抗体が欲しいわけではなく、とりあえず抗体作成が目的で大量に精製したいなら、高原さんの言うように大腸菌で作った方が無難かと。

(無題) 削除/引用 No.98-4 - 2011/03/04 (金) 00:24:00 - 高原 用途が抗原だけなら、Ｈｉｓタグ融合タンパクを大腸菌に作らせて、封入体から変性条件で回収してみては。

(無題) 削除/引用 No.98-3 - 2011/03/03 (木) 21:48:02 - Yoko 横から失礼。 >HEKはplasmidが増幅されますので、 の部分ですが、もうちょっと正確に理解＆記述した方がいいですよ。 文章の流れから、HEKは、HEK293Tのことを指しているとは思いますが、 それでも、文章からは、 HEK293Tは（すべての）plasmidが増幅できる、 と、間違った意味に解釈されてしまいます。

(無題) 削除/引用 No.98-2 - 2011/03/03 (木) 21:19:00 - aicezuki 大量というとmgオーダーですよね。 なかなかmammalでは厳しいかも。 うちではHEK293Tに分泌型で蛋白質を作らせていますよ。 遺伝子導入は一過性でDEAE-dextran法を用いています。 HEKはplasmidが増幅されますので、大量生産する場合には用いています。 Sf9 or Hi5が昆虫だといいでしょう。 酵母もありかなと。

抗原としての高分子量組換えタンパク 削除/引用 No.98-1 - 2011/03/03 (木) 11:01:25 - 抗体 ペプチドなどで抗体をいくつか試しましたがいい抗体が取れないので全長タンパクを抗原にしようと思ってます。タンパク（マウス/ヒト由来）が150kDなので大腸菌では難しそうなので別の系でいいものがあれば試してみたいと思ってます。Sf9の系はあると思いますが、最近フォローしてないので哺乳動物細胞株などを使って大量に精製できる方法などを知っている方がいらっしゃったら教えてください。ELISAなどが目的です。

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