BioTechnicalフォーラム [二重免染したい一次抗体どうしのホストが同じ]

二重免染したい一次抗体どうしのホストが同じ

No.975-TOPIC - 2011/09/26 (月) 15:57:45 - 困ってます

いつも大変お世話になっております。
培養細胞の免疫蛍光染色で、二重染色したい2種類の一次抗体どうしのホスト(動物種)が同じで困っています。お勧めのキットはございますでしょうか？

いずれの抗体もキャラクタライズが確立されており、できるだけその抗体を用いたい理由があります。

一次抗体をあらかじめ蛍光標識しておくMix-n-Stain CFキット(Biotium社)を用いようとしたのですが、その試薬が二次抗体の認識部位をマスクするわけではないため、二次抗体が結局結合してしまい、私の目的には合わないと説明書に記載されています。

2種類の抗体のそれぞれをこのキットの別色で標識しておく方法も考えられますが、2種類目の抗体はいくつか試そうと思っているためその数だけキットを購入せねばならなくなるので、できれば1種類目の抗体だけを標識して2種類目の抗体は普通に二次抗体で染色したいと考えています。

なお2種類ともIgG1なのでアイソタイプで染め分ける（不完全でしょうが）方法も不可能です。

どうかよろしくお願いします。
　

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(無題)

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No.975-14 - 2011/10/31 (月) 15:12:39 - 留学したことないですが

>今回は細胞サンプルだったので、また組織切片の際に参考にさせて頂きます。

すみません。組織切片の話だと勘違いしてました。
数日前にタイムリーに封入済みの塗抹標本などを剥がして染め直すというのを
みた覚えがあるのですがURLを失念していまして…
変わりにこんなページ（pdf）がありました。
ご参考までに
http://act.umin.ne.jp/imuno.pdf

ありがとうございます

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No.975-13 - 2011/10/28 (金) 22:40:06 - 困ってます

結局Zenon標識キットを一方の抗体にだけ用い、皆さんのおっしゃるような順番で処理を行ったところ、うまくいきました。つまり二次抗体が両方に反応してしまう現象はありませんでした。

ミラー切片、洗って染め直す、アドバイスありがとうございます。私も聞いたことがありますが、今回は細胞サンプルだったので、また組織切片の際に参考にさせて頂きます。

(無題)

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No.975-12 - 2011/10/28 (金) 16:58:24 - 留学したことないですが

ミラー切片を作ってみるとか…
　手間がかかる
　厳密に同じ切片じゃないと言われるかも

あと確か一回染色した切片を「洗って」染め直すという
荒業もあった気がします

(無題)

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No.975-11 - 2011/09/28 (水) 23:23:29 - ab

補足です。

> Zenonの標識Fabがポリクロかどうかは私にはわかりません。説明書には"goat Fab fragments selective for the Fc portion of mouse IgG antibodies of the indicated IgG isotype-IgG1, IgG2a or IgG2b-depending on the kit"とのみ記載されていました。私は一次抗体がいずれもmouse IgG1なので、IgG1の3色セットを購入するつもりです。
> Fc部分をじゅうぶん結合（マスク）するのかはわかりませんが、製品のうたい文句からするとそうでないと染め分けられません。

Zenonはポリクロです（goatのモノクロはまだありません）。
このキットでは、標識した後に大量のIgGを添加する事で結合していないFabをトラップして、もう一方の一次抗体につかないようにしています。そのため、Zenonで標識した抗体同士を使う分には問題ないです。
勘違いかもしれないのですが、意図が「片方を標識してもう片方は二次抗体で染めたい」、ということであれば、同時にやるのは交差の可能性があると思います。
片方を二次抗体までやってから、もう片方を標識一次抗体、であればよいのですが。

ちなみに、昔Zenonを使った事がありますが、二次抗体を使う場合に比べてかなりシグナルが弱かったです。巷の評判はとてもよいので、使う抗体によるのかもしれません。

訂正です

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No.975-10 - 2011/09/28 (水) 20:29:27 - 組織

×単染色をネガコンにおいて
○単染色をおいて

(無題)

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No.975-9 - 2011/09/28 (水) 20:25:16 - 組織

先ほどは色々と説明不足な書き込みでした、すみません。補足です。

私のラボでは抗体の標識には、Zenonではなく、DojindoのHyLite Fluorシリーズを使ってます。Zenonは興味はあるんですが、確かisotypeごとにキットを買う必要があった気がして（うろ覚えですが）、まだ試してません。Dojindoの方はマウスやウサギなど色々な種類の抗体に使いましたが、おおむね成功してます。ただ、1～2割くらいなぜかうまくいかない抗体がありました。

>理論上はできるはずだけれど、実際には微妙に両方とも染まってしまったりすると解釈に苦しむ（毎回ネガコンとよく比べないといけない）ことになると心配
ネガコンもそうですが、蛍光二重染色の場合は、初めて実験する際にそれぞれの抗体の単染色をネガコンにおいて、2種類の抗体間（カラー間）で交差反応がないことを確認する必要があると思います。今回だと、①未標識一次抗体Aと標識二次抗体、②標識一次抗体B、の単染色（シングルカラー）ですかね。

>isotypeで染め分けるというのは、一次抗体どうしのisotypeが異なる場合に使える方法ですよね？
その通りです。今回はあくまで参考情報としてお考えください。

訂正

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No.975-8 - 2011/09/28 (水) 19:22:52 - 困ってます

「毎回ネガコンとよく比べないといけない」
ネガコンでなく、二次抗体で染めた方のチャネルとの比較、ですね。

(無題)

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No.975-7 - 2011/09/28 (水) 19:18:46 - 困ってます

ありがとうございます。
mouse on mouseです。
Zenonの標識Fabがポリクロかどうかは私にはわかりません。説明書には"goat Fab fragments selective for the Fc portion of mouse IgG antibodies of the indicated IgG isotype-IgG1, IgG2a or IgG2b-depending on the kit"とのみ記載されていました。私は一次抗体がいずれもmouse IgG1なので、IgG1の3色セットを購入するつもりです。
Fc部分をじゅうぶん結合（マスク）するのかはわかりませんが、製品のうたい文句からするとそうでないと染め分けられません。

下記の情報ありがとうございました。実際に行っておられる方のご意見が聞けたので非常に参考になり、心強いです。理論上はできるはずだけれど、実際には微妙に両方とも染まってしまったりすると解釈に苦しむ（毎回ネガコンとよく比べないといけない）ことになると心配していましたので。

isotypeで染め分けるというのは、一次抗体どうしのisotypeが異なる場合に使える方法ですよね？

> [Re:2] 可能性さんは書きました :
> > 私なら未標識一次抗体→標識二次抗体、
> > その後に標識一次抗体の順で試してみますが。。。
>
> この方法で染色できると思いますが、何か別の問題があるのでしょうか？
> 私もこの手順でマウス抗体どうし、ウサギ抗体どうしの二重染色をやってます。

読み間違えているかもしれませんが・・

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No.975-6 - 2011/09/28 (水) 07:45:37 - 組織

>[Re:2] 可能性さんは書きました :
> 私なら未標識一次抗体→標識二次抗体、
> その後に標識一次抗体の順で試してみますが。。。

この方法で染色できると思いますが、何か別の問題があるのでしょうか？
私もこの手順でマウス抗体どうし、ウサギ抗体どうしの二重染色をやってます。

一次抗体の標識もどちらか1つでいいです。
標識一次抗体の方は二次抗体が不要なので、ちゃんと洗浄していれば、未標識一次抗体＋標識二次抗体と交差することはまずないと考えられます。

ちなみにアイソタイプ特異的二次抗体の組み合わせもよくやりますがうまくいってますよ。
二重染色ではラベル抗体よりもまずこちらを優先しますね。

MOM?

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No.975-5 - 2011/09/28 (水) 07:06:54 - en

mouse on mouse?

(無題)

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No.975-4 - 2011/09/28 (水) 04:07:08 - ab

> またこちらのキットならFc部分に結合するので、Fc特異的二次抗体を使えば私の考えていた方法でlabeling kitの節約も理論上は可能と思われます。

ふと思った事ですが。
それぞれの抗体をZenonで標識する分にはいいと思うのですが、Zenonの標識Fabもポリクロで、用いようとしている二次抗体もポリクロなので、Zenonの標識で完全に一次抗体のFc部分がブロックされるのか疑問です（エピトープが異なる抗体が多数存在する）。
立体障害で二次抗体由来のシグナルは減少しても、結局のところ結構残ってしまうのではないでしょうか？

ありがとうございます

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No.975-3 - 2011/09/27 (火) 19:24:08 - 困ってます

ありがとうございました。
確かに手順的にはそれがよいと思います。
InvitrogenのZenon labeling kitというのを見つけたのですが、それだと3色少量ずつのキットが存在したので、それにしようと思います。またこちらのキットならFc部分に結合するので、Fc特異的二次抗体を使えば私の考えていた方法でlabeling kitの節約も理論上は可能と思われます。
（Invitrogenの回し者ではありません）

(無題)

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No.975-2 - 2011/09/26 (月) 16:30:23 - 可能性

あげているキットのことは知りませんが、
私なら未標識一次抗体→標識二次抗体、
その後に標識一次抗体の順で試してみますが。。。

一次抗体の標識キットでB/F 分離していればできる可能性はあるかと

二重免染したい一次抗体どうしのホストが同じ

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No.975-1 - 2011/09/26 (月) 15:57:45 - 困ってます

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