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(無題) 削除/引用 No.969-11 - 2011/10/22 (土) 03:39:46 - K > 思いつきですが、1.5mlではなく500ulチューブで遠心できれば、境界面が小さくなり、なんとかなるかもとか、思ったりしました。 > > まぁ、500ulチューブを15000rpmで回せる遠心機を置いている研究室はあまり見かけないのが苦しいところですかね。 これ、いいアイデアですね。500 ulチューブはフタを切った1.5 mlチューブの上に置いて遠心すればいいですね。

(無題) 削除/引用 No.969-9 - 2011/09/29 (木) 22:29:49 - あらら コメントありがとうございます。 Trizolの量は多めで、クロロホルム混合後にできるだけ断面積の小さいチューブで高速遠心できればロスが少ないのですが、ハード的に難しそうです。 Trizolの量とイソプロ沈の効率はジレンマですね。最も効率の良い使用量があるのだと思いますが、もしかしたらそれがマニュアル記載の用量なのでしょうか・・・。 自分の実験系の事を考えると、スケールアップが最も現実的な方法のような気がしてきました。

(無題) 削除/引用 No.969-8 - 2011/09/29 (木) 20:47:37 - KY >[Re:7] ~さんは書きました : > ギリギリのTrizol(isogen?)だと、水相の量が少なくなり、水相回収時のロスが増えるのが悩ましいですね。 思いつきですが、1.5mlではなく500ulチューブで遠心できれば、境界面が小さくなり、なんとかなるかもとか、思ったりしました。 まぁ、500ulチューブを15000rpmで回せる遠心機を置いている研究室はあまり見かけないのが苦しいところですかね。

(無題) 削除/引用 No.969-7 - 2011/09/29 (木) 20:13:22 - ~ ギリギリのTrizol(isogen?)だと、水相の量が少なくなり、水相回収時のロスが増えるのが悩ましいですね。

(無題) 削除/引用 No.969-6 - 2011/09/29 (木) 19:00:35 - KY エタチンでは全体の容量が多いよりも、容量を小さく、濃度が高い方が同じ量のDNAでも沈殿効率があがると聞いたことがあります。 だから中間層のコンタミを避けるために、結果としてイソプロ沈殿の容量をが増えることは、沈殿の効率が下がるのではないでしょうか？ むしろ、ギリギリのTrizol(isogen?)で細胞を溶かしてクロロ加えて、できるだけ濃度を高くしてイソプロしたほうがいい気がします。

(無題) 削除/引用 No.969-5 - 2011/09/29 (木) 00:25:51 - あらら みなさまありがとうございます。マイクロではなくナノの間違いです。失礼しました。 まず、とれるべきRNAがとれているのか、スケールアップしたサンプルで収量を比較したいと思います。確かに、これが肝心ですね。 残念ながらカラムは予算上厳しそうです・・・。 既に共沈剤（グリコーゲン）は使っています。共沈剤はRNAペレットを見やすくするためだと認識していたのですが、収量も増加するのでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.969-4 - 2011/09/28 (水) 10:36:41 - ~ まずは、そこそこのスケールで1細胞あたりのRNA収量を調べ、 96ウェルプレートの1ウェルあたりの細胞数と収量を比較して、 妥当な結果であるかを確認してみるのがいいのではないでしょうか。 妥当な収量なのか、どこかでロスが考えられるのかが分からなければ、 限界かどうかは判断できないのではないでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.969-3 - 2011/09/27 (火) 09:25:19 - nanasi 1)フェノールクロロホルム抽出（ISOGENやTRIZOL抽出）ではなく、キアゲンやタカラ社のカラム精製に変更する。 ２）どうしてもフェノールクロロホルム抽出で実験する必要があるのならば共沈剤（グリコーゲン,ナカライテスク社 もしくはエタチンメイト,ニッポンジーン社）などを使用する。 でしょうか。

(無題) 削除/引用 No.969-2 - 2011/09/27 (火) 07:07:58 - ab いくつかの製品の取扱説明書に予想収量が書いているので、計算してみるとよいと思います。 細胞の種類でかなり違いますが、ざっと計算すると、96-wellの1well分で200-1000 ngくらいが予想収量のようです（マイクロではなくてナノですよね）。 なので、200-300 ngというのは、その細胞で適切な量な気もします。 RT酵素をいいものにできないのなら、もう少しスケールを大きくした方が現実的ですよ。

RNAの収量を増やしたい 削除/引用 No.969-1 - 2011/09/25 (日) 12:37:56 - あらら よろしくお願いします。 培養細胞からRNA抽出→RT-PCRという作業を頻繁に行っています。 初代培養でもあり細胞を節約するため、96-well-plateで培養しRNA抽出しています。 今のところ1-wellからtotal RNA 200-300ugくらいの収量です。使っているRTaseの感度上、もう少し多く取れればいいと考えています。現段階で留意しているのは・・・ ・抽出試薬を多めに使い(1ml)、クロロホルム混合後の水層のロスを減らす。 ・イソプロ後の遠心を30分と長め。 くらいです。他にコツなどありますでしょうか？　無ければ、この細胞ではこのくらいの量が限界なのかとあきらめ（？）ます・・・。 ご教授頂ければありがたいです。

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