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(無題) 削除/引用 No.962-5 - 2011/09/27 (火) 14:35:07 - jiko おそらくPFAの24時間固定の時に、siRNAが溶出してしまっていると考えられます。

(無題) 削除/引用 No.962-4 - 2011/09/23 (金) 22:54:05 - Harmonia 観察までの処理で、細胞の透過性がよくなって、見たいものが流れ出ているとか？

(無題) 削除/引用 No.962-3 - 2011/09/23 (金) 20:01:08 - のるむ PFA処理でAlexa568が変化して退色することはないはずですが、PFAがAlexa分子の近傍に大量に存在していると蛍光を出さない、ということはあるような気はします。emaさんの書かれたpaperにアクセスできないのでそのことなのかもしれません。PFA固定後に、PBSで一度リンスされてますか？このせいであれば、切片を作るまでの間、どこかで過剰のPFAが洗い流されればいいということになり、解決はできそうです。無駄にお金はない方が、技術も知恵も上がりますよ。

いちおうネット上では 削除/引用 No.962-2 - 2011/09/22 (木) 19:22:12 - ema alexa fluor 568、コンジュゲートしたsiでは使った事無く、通常の標識抗体で４％パラホルムで変な事になった事はないです。moleculer Probeの使用書もアルデヒド系の固定溶液でOKと書いてあるし。 ネット検索して、下記のような現象はあるみたいです。 www2.bpe.es.osaka-u.ac.jp/paper/jp/nou21_2010_okamoto.pdf

パラホルムアルデヒド固定が蛍光色素へ与える影響 削除/引用 No.962-1 - 2011/09/22 (木) 17:48:11 - ビオテク どなたか蛍光色素(alexa fluor 568)のパラホルムアルデヒドに対する安定性を御存じの方いましたら、教えて頂けませんか。 現在、alexa fluor 568修飾したsiRNAをマウスの尾静脈から投与し、１時間後に肝臓を摘出し、４%パラホルムアルデヒドで２４時間固定した後、凍結組織切片を作製し、共焦点顕微鏡により蛍光を観察しているのですが、まったく蛍光が見れません。 培養細胞へリポフェクションにより導入した場合は蛍光を観察できているため、退色ではないと考えますが、ビボでの実験であるため、原因究明に苦戦しています。 本来であれば、様々な条件検討を行うべきであると考えていますが、私の所属する研究室は予算が少ないため高価な蛍光修飾したsiRNAを何度も注文することができません。 そこで、みなさんのお知恵をお借りしたいです。 私としては、原因の一つにパラホルムアルデヒドによる固定が蛍光色素の蛍光を弱めてしまっている可能性があると考えているのですが、パラホルムアルデヒド固定が蛍光色素へ与える影響に関する知見をお持ちの方、御教示頂けませんでしょうか。

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