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不活化菌体のプラスミド トピック削除
No.96-TOPIC - 2011/03/02 (水) 22:11:27 - apes
いつも参考にさせていただいたおります。

組換えタンパク質を発現する大腸菌をホルマリン、あるいはアセトンで不活化して生理食塩水で洗浄後、マウスに経口投与し、免疫反応を観察しようとしています。

1. ホルマリンあるいはアセトンで不活化した大腸菌中のプラスミドはどのような状態になっているのでしょうか。

2. ホルマリンあるいはアセトンで不活化した大腸菌中のプラスミドは腸内の他の細菌に伝達されるのでしょうか。

いろいろ調べたのですが、報告が見つからず困っています。ご教授の程、よろしくお願いいたします。
 
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不活化菌体のプラスミド 削除/引用
No.96-13 - 2011/03/08 (火) 19:43:11 - apes
おお様、actias様

ご返信ありがとうございました。
もちろん最終的な判断は安全委員会が行うことを
大前提としてトピックを挙げさせていただいています。

ただ、論文などを参照していると、さまざまに
矛盾点が生じてきまして。特に食べるワクチンとか、あるいは
組換え型の経口ワクチンなんかはどのように安全性を担保しているの
でしょうね。

腸内細菌への移行がもっと明確になるようであれば、DNAを飲ませる
こと自体が組換え実験になるのかも知れません。

気軽に挙げたトピックにたくさんの御返信をいただき
ありがとうございました。

(無題) 削除/引用
No.96-12 - 2011/03/05 (土) 10:55:19 - Actias
ざっと呼んだ限りですが...

結論は、「疑問点をご所属の組織の安全委員会に聞いてください」

大事なところなので、結論を先に書きました。

引っかかる点は、意図しない組換え生物が生まれる可能性です。

これは、遺伝子組換え生物等規制法の
研究開発等に係る遺伝子組換え生物等の第二種使用等に当たって執るべき拡散防止措置等を定める省令
いわゆる二種省令の「大臣確認実験」という判断が出てもいいと思います。

経口投与する大腸菌は、不活化されているので、「生きている組換え大腸菌というところに着目するなら」問題ないと思います。

一方、その大腸菌が持つ核酸が、遺伝子組換え生物を生み出すのに十分な能力かどうかは現時点で分かっていませんので、「能力ありとみなし」ておきます。それを腸内細菌に与えた場合、論文が有るというのですから、何らかの腸内細菌が組換え生物になる可能性があります。
その組換え生物の種類は、二種省令で定めた種類(これこれこういう種類という表があります)ですかというと、すべての腸内細菌の種類を把握していないのであれば、その表に載ってない微生物もいるかもしれませんので、「載ってないとみなし」ます。
載ってない場合は大臣確認です。
(安全側に倒した意見です。仮定に基づいた考えであることも承知しています)

No.96-11 おおさんの疑問に対しては
「組換え動物等のふん尿等の中に遺伝子組換え生物等が含まれる場合は」
の限定つきですが、「当該ふん尿等を回収するために...」(別表第四)とあり、常識的にはふん尿も不活化処理後に廃棄されるはずですから、知らず知らずに、適切に処理されているはずです。

(無題) 削除/引用
No.96-11 - 2011/03/05 (土) 02:41:15 - おお
胃酸のある環境でDNAは可也不安定であるという予測はありますね。もしDNAがちょう内の細菌に移行するという心配をするのであればトランスジェニックのマウスの組み込まれたゲノムないの耐性遺伝子に対しても考慮があってもおかしくないようなきがしますが。。。

実験後マウスを野放しにする訳ではないので、ちょう内細菌にどこまで組かえ遺伝子の規制がかかっているんでしょうか。。。

この辺よく分からないので詳しい方が入ればいいですね。。。

不活化菌体のプラスミド 削除/引用
No.96-10 - 2011/03/04 (金) 17:01:41 - apes
~様、ats様、おお様

勝手な推測と興味におつきあいいただいてありがとうございます。
不活化の方法が適切がどうか別として、死滅菌体から溶出(外部に放出される)されるであろうゲノムを含めたDNAを生物と扱うのかどうか。DNAを直接経口投与することと違いがないようにも思います。

経口投与したDNAの腸内細菌への取り込みはあるとする論文と無いとする論文の双方が存在します。DNAを経口投与することは組換え実験になるんでしょうかね。

実験はおもしろそうなんでやってみたいんですが、趣味でできるものでも
なさそうなんで。先立つものが。

どうもありがとうございました。

(無題) 削除/引用
No.96-9 - 2011/03/04 (金) 16:12:21 - おお
まずガイドライン的にいうと組かえ体の不活化はブリーチかオートクレーブなどの滅菌ではなかったでしょうか。裸のDNAをオートクレーブしてどこまで不活化できるか疑問ではありますが。

なので不活化したという点で違う手法がどこまで認められるかといういみで疑問があります。ホルマリンであればクロスリンクがおこり、DNAとしての活性は可也低下すると思いますが、アセトンは化学的にDNAは変化しないでしょうから、アセトン処理した後抽出するとほぼいんたくとのDNAが取れるかもしれません。固定するぐらいであればライセーとの粗抽出液とかにする方がいいのではないでしょうか。

(無題) 削除/引用
No.96-8 - 2011/03/04 (金) 11:34:46 - ~
自分で検討するのであれば、人工胃液や人工腸液の処理もしてみる必要があるかもしれませんね。

実験を組む際には、外部(官庁?)に根拠として示せるような実験内容が求められるでしょうから、その実験計画自体を安全委員会と相談してからやらないと、2度手間になるのでは。
(ホルマリンで殺菌しているので、何もしなくてもいいのかもしれませんし)

実験してみては。 削除/引用
No.96-7 - 2011/03/03 (木) 19:35:47 - ats
大腸菌内のplasmidには、複製・転写関連酵素やヒストン様タンパクが結合していますから裸ではないです。それらが固定されると、容易には菌体外に出て行きそうにないと思いますけど。
plasmidの拡散が心配なら、簡単な実験で確かめられると思います。
例えば、固定化した大腸菌と大腸菌のコンピテントセルを混合し、plasmid由来の薬剤耐性菌が出現するか否かを確かめるとか。人工的なコンピテントセルは、体内にいるかもしれないコンピテントセルより遥かに効率が良いでしょうから、安全性の検討が出来ませんか。

(無題) 削除/引用
No.96-6 - 2011/03/03 (木) 19:27:07 - ~
安全側の立場で見ると、

DNAの変性:
ホルマリン固定した組織からDNAを抽出してPCRができますので、ホルマリンでDNAが完全に変性するわけではないのでしょう。
また、ゲノムDNA抽出でアセトンで洗うプロトコルを見かけたので、アセトンでもDNAは変性しないのでしょう。

腸までの輸送:
キトサンとDNAを抱合させて、腸管細胞に遺伝子導入する報告を見かけました。
キトサンは多糖で、大腸菌にも多糖が含まれますので、腸管にまで届く可能性は否定できないでしょう。

形質転換:
大腸菌では非接合性・非ウイルス性の遺伝子水平伝播現象が報告されているようですが、それが腸内で起きないことも否定できないでしょう。


それらの可能性を否定できるだけの基礎データを用意しないと、安全と言い切るのは困難でしょう。

また、そのプラスミド自体も規制に影響するのではないでしょうか。
アンピシリン薬剤耐性遺伝子が乗っただけのベクターと、ベロ毒素などを発現するベクターでは、規制のかかり方は変わってくると思いますけど。

不活化菌体のプラスミド 削除/引用
No.96-5 - 2011/03/03 (木) 18:47:30 - apes
nana様

御返信ありがとうございます。

もちろん生物ではないのですが、消化管での菌体の分解後にプラスミドが腸管内に出てくるんじゃないだろうか。コンピテント化しているバクテリアが近所にいれば取り込まれやしないかと。拡散しないとは言い切れないんですかね。

(無題) 削除/引用
No.96-4 - 2011/03/03 (木) 16:02:09 - nana
遺伝子組換え実験の規制については
ご所属の組織に安全委員会があるはずですので
疑問があればお問い合わせいただくべきものと思います。

個人的には、大腸菌が確実に不活化されているのであれば
すでに生物ではありませんから、遺伝子組換え実験には
ならないのではないかと思いますが、いかがですか。

不活化菌体のプラスミド 削除/引用
No.96-3 - 2011/03/03 (木) 11:01:25 - apes
nana 様

ご返答ありがとうございます。
ご指摘のように、遺伝子組換え実験の規制がどの程度かかるかどうかの判断と、
純粋な知的興味です。

ご存じでしたらご教授いただければ幸いです。

(無題) 削除/引用
No.96-2 - 2011/03/03 (木) 08:41:24 - nana
ご懸念の理由がよくわからないのですが、
遺伝子組換え実験の規制との関係ですか?
あるいは、単純に実験条件を整えるためですか?

不活化菌体のプラスミド 削除/引用
No.96-1 - 2011/03/02 (水) 22:11:27 - apes
いつも参考にさせていただいたおります。

組換えタンパク質を発現する大腸菌をホルマリン、あるいはアセトンで不活化して生理食塩水で洗浄後、マウスに経口投与し、免疫反応を観察しようとしています。

1. ホルマリンあるいはアセトンで不活化した大腸菌中のプラスミドはどのような状態になっているのでしょうか。

2. ホルマリンあるいはアセトンで不活化した大腸菌中のプラスミドは腸内の他の細菌に伝達されるのでしょうか。

いろいろ調べたのですが、報告が見つからず困っています。ご教授の程、よろしくお願いいたします。

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