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御礼 削除/引用 No.957-10 - 2011/10/14 (金) 14:41:44 - nyamo ご回答して下さった皆様、本当にありがとうございます。 実験計画を立てる上で、大変参考になりました。 実験の件ですが、RNA干渉を行った際に、 PCRでバンドを確認するとともに、 とりあえず、その遺伝子がタンパクレベルで発現したときの機能(この場合はスーパーオキシドの産生)を調べ、 両者の結果からノックダウン効果とタンパクの機能にせまる、という方向で実験をすすめています。 WBを行ってみたいと思うのですが、 抗体やゲルの購入、設備等で少し実験を行いにくい条件が揃っていて、 来年、科研費が入ってから検討しようと思います。

(無題) 削除/引用 No.957-9 - 2011/10/05 (水) 06:55:41 - ab > ノックダウンの効果を見るのなら、タンパク質が減っているということを見た方が > 良いんじゃないのって思っちゃいます。 この意見に同感です。 WBではノックダウンの効果が見えるけど、RT-PCRでは見れない（見づらい）ことも結構あります（プライマー次第）。 目的の分子に対するよい抗体があればWBした方がよいですが、どうしてもPCRでなければいけないなら、ターゲット領域の前後のプライマーを使った方が無難でしょう。

(無題) 削除/引用 No.957-8 - 2011/10/03 (月) 12:30:13 - Q RNAに着目してどうこう言うのもいいですが、 それほど重要でないところでガタガタ言うよりも、 ノックダウンの効果を見るのなら、タンパク質が減っているということを見た方が 良いんじゃないのって思っちゃいます。

本題とは関係ありませんが・・・ 削除/引用 No.957-7 - 2011/10/03 (月) 11:37:06 - シリウス ＞Harmonia さん ＞PCR の怖いところは、一つ一つの分子に注目すればズタズタに分断された鋳型でも、十分量の複数の鋳型が集まれば、鋳型を乗り換えながら分断される前の長さを再現できる、 本当ですか？ にわかに信じられませんが・・・ ＞鋳型量を反映する結果を得ることができる鋳型量が限定的、といことです。 私は、この意味が分かりません・・・

(無題) 削除/引用 No.957-6 - 2011/10/01 (土) 09:27:26 - Harmonia PCR の怖いところは、 一つ一つの分子に注目すればズタズタに分断された鋳型でも、十分量の複数の鋳型が集まれば、鋳型を乗り換えながら分断される前の長さを再現できる、 鋳型量を反映する結果を得ることができる鋳型量が限定的、 といことです。 ターゲット領域とターゲット領域外で、バンドが見えているときは、 ノックダウン効果なし、 効果があったけどズタズタに分断された鋳型に分解されるにとどまった、 の二つが少なくとも考えられます。 先の２点目の返答に書きましたが、両者で共にバンドが見えないときが一番悩ましいです。「見えない」は、 見えるはずだけど見えない、 見えないから見えない、 のどちらかは言い切れないからです。 揚げ足取りと言われるかもしれませんが、「見えない」原因は、 　RNA 抽出の不完全 　RNA 抽出後の分解 　逆転写の失敗（酵素、バッファの入れ忘れ、不適切な反応条件） 　PCR の失敗（プライマー設計ミスほか、同上） 　PCR 後の失敗（泳動の失敗、バンド検出の失敗） こういうと、 「ラボのプロトコール通りだから、間違いありません」 と反論する方が居るけど、論文投稿では、そのようには書けませんよね。 効果があるのに、効果が無かったように見えた場合の対処は他の方にゆずるとして、効果の確認を RNA による方法、 RNA から合成したcDNA による方法、 翻訳されたタンパク質による方法、 のそれぞれで考え、室の方針、人力、予算からどれを実施し、どれを実施しないか、またそのとき、実施する方法（複数)は異なる検出方法（検出レベル）と言い切れるかを考えてください。

(無題) 削除/引用 No.957-5 - 2011/09/26 (月) 23:50:47 - primer siRNAで分解されたRNAは徐々に分解されるが、分解の速度はsiRNAによる切断速度に比べてかなり遅いので、切断されたmRNAが残る。 発現量がそれほど高くなく、十分時間が経っていれば問題ないが、元々の発現量が強い場合は、プライマーの設計場所とRT反応の条件によっては、切断されたmRNAを拾ってくる場合がある。 そのため、切断部位を挟まないプライマーは、切断部位の5'側に設計し、RTはランダムプライマーではなく、oligo dTを用いるとよい、とどこかで読んだ。

(無題) 削除/引用 No.957-4 - 2011/09/24 (土) 23:10:16 - nyamo ご回答、ありがとうございます。 mRNAは切断されると不安定になり、 mRNAがどんなに長くても、cap構造やpolyA-tailが無くなると分解されるということですね！ 念のため、ターゲット領域とターゲット領域外でプライマーを作製し、 ノックダウンの効果をPCRによって比較してみます。

(無題) 削除/引用 No.957-3 - 2011/09/23 (金) 08:42:54 - opportunity 専門学校卒です。 頭のなかで考えてみました。 質問1: mRNAがsiRNAにより切断されると、安定性がなくなって 分解されてしまうと思います。mRNAはcap構造やpolyA-tailにより 細胞内で安定だからです。 質問2: よりましてターゲット領域外で作成して良いと思います。 切断部位の両側でPCR Primerを設定し、リアルタイム定量PCRなどで 定量、比較できれば、分解度合いが分かると想像します。

(無題) 削除/引用 No.957-2 - 2011/09/22 (木) 22:04:10 - Harmonia ■1点目 そういう文献が有るはずなので、探してください。 ■2点目 やりたいことが実現できるなら、それで良いと思います。 ただし、存在するものを検出することは簡単ですが、存在しないものを検出することはできません。存在しない可能性がどのくらい高いかを述べることしかできません。 やりたいことを考える＞そのための手段を考える＞その手段はやりたいことを反映しているか考える＞その手段はやりたいこと以外を反映していないかと考える。 なぞなぞのようですが、それができているかどうかが、実験の精度（確からしさ)を決めます。

RNA干渉における疑問 削除/引用 No.957-1 - 2011/09/21 (水) 22:26:35 - nyamo こんばんは。 遺伝子を扱う研究室に所属する大学生です。 来月、RNA干渉法を用いて5,000bpのある遺伝子のノックダウンを行うことになりました。 現在、ノックダウンのターゲット領域に相当するdsRNAと、ノックダウン効果を確認するためのプライマーを作製しています。 そこで疑問が2点でてきました。 ■1点目； mRNAについて、ノックダウンのターゲット領域はDicerやRISC等の働きにより切断→認識→分解されますが(ここまではよく参考書に書かれています)、ターゲット領域外はどうなのでしょう？ 例えば、ターゲット領域がノックダウンされると、ターゲット領域外が3,000bpあったとしても、こちらも何らかの作用で分解されますか？ ■2点目； 1点目の答えによりますが、ターゲット領域外において、ノックダウン効果を確かめるためのプライマーを作製することは良くないでしょうか？ どうかご教授宜しくお願い致します。

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