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落とし穴 削除/引用 No.951-9 - 2011/09/26 (月) 10:34:45 - エレキバン キャパシティの問題くらいは普通考えて実験しているはずなので問題にしません。 抗体のみでIPしてみて下さい。 もしIPできるのであれば、サンプルとmagnetic beadsの相性の問題です。 知ったかぶりでProteinG beadsならなんでもOKだと思いがちなのですが、 抗体を変えるとIPできなくなることがあり検討したところどうもmagnetic beadsに問題があることがありました。1つのメーカーしか試していませんが面白いですよね。いくつか原因は考えられますが面倒なので追求していません。このような裏情報をやりとりするのがこの掲示板の良さですよね。ちゃんとコントロールをとって実験すれば分かるのですが時間がもったいないですよね。だれかが人柱にならなければ分からないこのような情報はDNAワークでは多くしられていますがその他ではいまいち。 良いスレだと思います。

比較 削除/引用 No.951-8 - 2011/09/25 (日) 18:06:32 - Kanata 既にご存知かとは思いますが、GEがこのような比較表を掲載しています。 http://www.gelifesciences.co.jp/technologies/immuno_precipitant/lineup.asp

メーカーに苦情を言う前に 削除/引用 No.951-7 - 2011/09/25 (日) 10:52:46 - ナデシコ組 GEのProtein AゲルとDynabeads ProteinAを例にカタログ仕様を比較すると、 GEのキャパ(hIgG): 50mg (1ml=40mgあたり）→1.25mg/mg-gel Dynabeadsのキャパ(hIgG): 0.25mg（30mgあたり）→0.0083mg/mg-bead 同じ重さ当たりでキャパシティに150倍の差。 収量に差があるのは単にキャパシティの差です。 実験前に計算くらいして、実験の目的にあった方を選びましょう。

(無題) 削除/引用 No.951-6 - 2011/09/25 (日) 06:14:36 - Kanata キャパシティの違いに加えて、ブロッキングの仕様の違いもあるように思います。 共同研究者と当方で異なるメーカーの磁気ビーズを使って同じ条件でIPをしたのですが、得られた結果にかなりの差がありましたーーといっても患者さんのサンプルを使ったので厳密な比較ができないのですが。 一方からは非特異的吸着とみられる蛋白質が多数検出されました。 サンプルがある程度の量あるのならば通常のセファロース・アガロースゲル（ビーズ）を使えますが、少量の場合は磁気ビーズの方がサンプルロスが防げます。同時に量が少ない分ビーズのキャパシティが少なくても問題にはならない、そう理解しています。

(無題) 削除/引用 No.951-5 - 2011/09/22 (木) 23:56:48 - 小言幸兵衛 シリウスさんの仰る理由で。ビーズの容量あたりのキャパシティーが全然違います（それが仕様です）。カタログやマニュアルに記載されているキャパシティーの通りに揃えてなお効率が悪いということでしょうか。それとも、何も考えずに同じ容量のビーズを使った結果でしょうか。

(無題) 削除/引用 No.951-4 - 2011/09/22 (木) 22:50:16 - シリウス セファロースビーズはビーズの内孔で結合反応が行われるのに対し、磁気ビーズ（Dynabeads）はビーズの表面で結合反応が行われます。 恐らく、結合が行われる絶対面積が、セファロースビーズの方が、磁気ビーズよりも大きいため、これが、収量の差となっていると考えられます。 セファロースビーズと比較したことはありませんが、Dynabeadsで問題なく免疫沈降できています。 自分自身で確認したわけではないのですが、上述のことを踏まえて、回収量を上げたい時にはセファロースビーズ、非特異的結合を減少させたいときにはDynabeadsを使えばよいのかなと思っています。

(無題) 削除/引用 No.951-3 - 2011/09/22 (木) 14:02:01 - HＴ hiroさんご回答ありがとうございます。 やはりそうですか。販売元に聞いてみても、収量少ないっていうクレームは これまでに無いとのことで、プロトコル通りにやってくれとしか言われず、 どうしたものかと思っていました。 結構高いものですが、今は従来通りの方法に戻そうと思います。 ありがとうございました。同じような問題がある方がいて参考になりました。

(無題) 削除/引用 No.951-2 - 2011/09/22 (木) 13:38:59 - hiro 同感です。磁気ビーズだとなぜか収率が下がります。いろいろなのを試してみましたが、安定して使えるくらいの収量でとれたのはなかったので、普通のやり方に戻しました。電顕用のような、純度しか関係しないのならばいいのですが、生化学的なルーチンワークには向かないような気がしています。

磁気ビーズでIP効率悪い 削除/引用 No.951-1 - 2011/09/21 (水) 13:51:21 - HＴ 大腸菌で作成した2種類の組換えタンパク質を用いてCo-IP実験をしています。 FLAGタグとGSTタグを使っていますが、Protein Gが結合した磁気ビーズで IPしているのですが、FLAGタンパク質どころか抗体そのもののpull-downも 大変効率が悪く困っています。 普通のセファロースビーズですと問題無いので、そちらで実験しようとも 思うのですが、原因が何なのか、改善点があればと思い投稿させてもらい ました。 バッファーはTrisやPBSなどを用い、0.1% Tweenを入れています。 マグネットで磁気ビーズを吸着させると、ビーズが凝集して極めてけん濁 しずらい状況になります。 またいくつかの会社から磁気ビーズは販売されているようですが、お奨めの ものがあれば教えて頂ければ助かります！

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