全9件 ( 1 〜 9 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

(無題) 削除/引用 No.92-9 - 2011/03/04 (金) 13:23:28 - kudann2001 すみません、自己解決しました。 過去のトピックで確認できました。 http://www.kenkyuu.net/cgi-biotech/biotechforum.cgi?mode=view;Code=2680

(無題) 削除/引用 No.92-8 - 2011/03/04 (金) 11:38:48 - kudann2001 ＡＰ様： すみません、もうひとつ教えてください。 asymmetric PCRで一本鎖DNAプローブをつくる際に、DIG DNA ラベリングミックスを用いて行っていると思いますが、 http://www.roche-biochem.jp/catalog/index.php/product_3.6.12.2.4.1 ラベリングミックスの濃度は、毎回プローブごとに濃度を振って条件検討なさっていますか。 それとも、まずは原液で行うことがデフォルトで、ＰＣＲのかかりが悪ければ希釈して試す、という程のものでしょうか。

ありがとうございました。 削除/引用 No.92-7 - 2011/03/03 (木) 19:33:50 - kudann2001 ＡＰ様 再々のお返事、有難うございます。 僕は今まで、加水分解がデフォルトという事を知らなかったため、ＡＰ様の言いたい内容がいまいち伝わっていなかったのですが、今回は理解出来たと思います。 またＤＮＡプローブのハイブリ条件に関しても、有難うございました。 お教えいただいた事を踏まえ、ＤＮＡプローブを試してみようと思います。

(無題) 削除/引用 No.92-6 - 2011/03/03 (木) 18:42:33 - AP >ところで、１コピーあたりの標識が多い長さのプローブを（150ｂｐではなく。300bpとか500bpとか）作り、加水分解せずに用いるという考え方は、あまり良い方法ではないでしょうか。 プローブの分子量が大きいと、組織標本に浸透しづらいので、ハイブリをさまたげますし、逆にフリーのプローブもWashで落ちにくくなります。whole mountなんかでひどいときには、標本の表面にべったり吸着して真っ黒、だけど内部は全然染まっていないという状態になります。 1 kbだとか長いプローブでも断片化しなくていいという人もいるようですが、私は信じません。たぶん、そんなに長いと、RNAプローブ合成が全長まで行かないで、途中で止まった短いのができていて、それがたまたまうまく働いただけなんじゃないかと思います。 >もしよろしければ、ＡＰ様が通常行っているＤＮＡプローブ使用時の、ハイブリや洗いの温度や条件等をお教え頂けないでしょうか。 RNAプローブのハイブリは酸性条件で55〜65℃、DNAプローブの場合は42〜48℃です。ISHの場合、Washでstringencyをコントロールするのはほとんど効果がありませんので、Washは同じ条件です（室温で、プローブなしのハイブリバッファーからPBTに徐々に置換しながら）。

(無題) 削除/引用 No.92-5 - 2011/03/03 (木) 12:29:02 - kudann2001 AP様 ご丁寧なご回答、本当にありがとうございます。 ・DNA-RNAハイブリッドより、RNA-RNAハイブリッドの方が安定（Tmが高い）。 →この点は、ハイブリの条件（温度など）などでコントロールして、プローブ種に適した条件にすれば、同等の結果が得られるはず。 ↑ ありがとうございます。 もしよろしければ、ＡＰ様が通常行っているＤＮＡプローブ使用時の、ハイブリや洗いの温度や条件等をお教え頂けないでしょうか。 そういう心配をする論拠はなんでしょう。短いプローブだと特異性が下がるというアイデアはどこから？　そのへんは過去トピで言い尽くしたと思うのですが。 ↑ 過去トピも参照したのですが、質問の意図は、断片化して100〜300ｂｐにした場合、さらに短い断片もたくさん出来るので、同時に非特異も上がるのでは、というものです。 また僕は現在まで、下記の本やロシュのマニュアルを参照していたのですが、 http://www.yodosha.co.jp/book/9784897064192.html 1 kbのプローブを作っても、完全長のまま使うわけではなく、断片化して使うのが普通です。 ↑ 完全長のまま使うものだと思い込んでいたため、おかしな質問になってしまったかと思います。 ところで、１コピーあたりの標識が多い長さのプローブを（150ｂｐではなく。300bpとか500bpとか）作り、加水分解せずに用いるという考え方は、あまり良い方法ではないでしょうか。 以上よろしくお願いします。

もうしわけありません。 削除/引用 No.92-4 - 2011/03/03 (木) 12:27:54 - kudann2001 Ami様： いい習慣ではないと思う＞公共の掲示板での個人的なやりとり希望 ↑ 僕も全く同意見です。本当に申し訳ありません。 ただ今回の場合、 ・過去の同様のトピックを参照した時、回答者が極端に限定されていた ・回答者に連絡を取るすべが他になかった ・質問の内容を公開することは、本掲示板を閲覧する皆様に有益だと思われた 以上３点のことから、さんざん迷った末このような形となりました。 上記に関しては言い訳にもならないと僕自身思いますが、何卒ご容赦いただけないでしょうか。 かさねがさね、申し訳ありません。

(無題) 削除/引用 No.92-3 - 2011/03/02 (水) 22:22:20 - AP >１．ＲＮＡプローブと比較して、ＤＮＡプローブの発色強度は、具体的に（感覚的で結構です）何割程度か？ プローブ種に対して最適な条件で行えば、感度に大差はないと思います。 一般的にDNAプローブよりRNAプローブのほうが感度がよいといわれていますが、それは次の二点によります。 ・DNAプローブは一般的に二本鎖であるのに対し、RNAプローブは一本鎖である。二本鎖プローブはプローブ同士のアニールがおこるので標的に対するハイブリ効率を減衰させる。そのため、Molecular Cloning（3版に出てるかどうかは未確認だけれど、旧版には）によると、（記憶によれば）一本鎖プローブの方が二本鎖プローブより８倍ほど感度がよいという。 →この場合、DNAプローブでも一本鎖なので関係ないはず。 ・DNA-RNAハイブリッドより、RNA-RNAハイブリッドの方が安定（Tmが高い）。 →この点は、ハイブリの条件（温度など）などでコントロールして、プローブ種に適した条件にすれば、同等の結果が得られるはず。 また、RNAプローブは感度が高いとされる一方、バックグラウンド、非特異的ハイブリも高くなりやすいといわれています。そのために、ハイブリ温度をかなり高く設定したり、washの時にRNase Aで処理してフリーのプローブを分解したりという必要が出てきます。一長一短というところです。 >２．成書では１ｋｂ程度のプローブを推奨しているが、300 bp以下のプローブで非特異結合や特異性は特に問題は無いか？ そういう心配をする論拠はなんでしょう。短いプローブだと特異性が下がるというアイデアはどこから？　そのへんは過去トピで言い尽くしたと思うのですが。 念のため言うと、1 kbのプローブを作っても、完全長のまま使うわけではなく、断片化して使うのが普通です。300 bpのプローブを使った場合と、1 kbのプローブを平均300 bpに断片化して使うのとで、生じる可能性が変わってくる性質の心配なのでしょうか。

あんまり 削除/引用 No.92-2 - 2011/03/02 (水) 19:57:39 - ami3 いい習慣ではないと思う＞公共の掲示板での個人的なやりとり希望

ＡＰ様：in situ hybridizationにおけるＤＮＡプローブに関して 削除/引用 No.92-1 - 2011/03/02 (水) 15:15:08 - kudann2001 名指しでは大変失礼かと散々迷いましたが、下記のトピックのやり取りを踏まえた結果、この様なタイトルが妥当ではないかと考えました。 かさねがさね、ご無礼をお許しください。 http://www.kenkyuu.net/cgi-biotech2/biotechforum.cgi?mode=view;Code=2721 http://www.kenkyuu.net/cgi-biotech3/biotechforum.cgi?mode=view;Code=3797 さて質問ですが、以下の点です。 １．ＲＮＡプローブと比較して、ＤＮＡプローブの発色強度は、具体的に（感覚的で結構です）何割程度か？ ２．成書では１ｋｂ程度のプローブを推奨しているが、300 bp以下のプローブで非特異結合や特異性は特に問題は無いか？ 以上、何卒よろしくお願い致します。 またその他注意点等ありましたら、お教え頂ければ有り難く思います。

全9件 ( 1 〜 9 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

パスワードを入力してチェックした記事を

チェックした記事を

このトピックにメッセージを投稿する 名前  メール  　アドレス非公開    タイトル  本文       設定  クッキーを保存（次回の入力の手間を省けます） 上に上げない（トピックの一覧で一番上に移動させません） 解決（問題が解決した際にチェックしてください） 暗証  半角英数字8-12文字の暗証番号を入れると、あとで削除、修正ができます。 送信

---

〔使い方〕 「アドレス非公開」をチェックすれば、自分のメールアドレスを公開しないで他の方からメールを受け取れます。 問題が解決した際には、解決ボタンをチェックして解決した旨のコメントをつけてください。これは、初めにトピックを作った人と管理人のみが可能です。 半角カタカナ、機種依存文字(全角ローマ数字、○の中の数字等)は文字化けの原因となりますので使わないでください。

---