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Re以下のプロトコルでうまくいっています 削除/引用 No.907-8 - 2011/09/29 (木) 19:05:40 - little 詳しくありがとうございます。 お礼が大変遅くなって申し訳ありません。 Cot1 DNA mouse ssDNAを購入し、後日実験に望む予定です。

以下のプロトコルでうまくいっています 削除/引用 No.907-6 - 2011/09/13 (火) 01:11:13 - FISH Preparation of Hybridization mix 01. Ethanol precipitation of probe with Cot-1 and ssDNA. 20~50 ng of BAC probe 5 ug of Cot1 DNA 5 ug of ssDNA 02. dissolve with 2 ul of deionized formamide. 03. incubate it at 50°C for 30 min. 04. Denature the probe by incubating at 75°C for 5 min. 05. Chill it on ice. 06. Add 2 ul of 2x hybridization mix 2 x hybridization mix; 20 % Dextran sulfate 4x SSC 1 mM EDTA 0.05% TritonX 1 mg/ml PVP 1 mg/ml BSA 07. incubate it at 37°C for 30~60 min to block repetitive sequences. Preparation of specimen 01. Pepsin treatment: 0.002% pepsin/0.01N HCl for 4 min at 37C prepare 0.01N HCl (37C) and add pepsin stock solution just before use. 02. Wash with 2x SSC for 3 min twice. 03. Post-fixation in 1% PFA/PBS for 3 min at RT. 04. Wash with 1x PBS twice. 05. Stock in 70% EtOH. Setting up for hybridization 01. Transfer the slide in 100% EtOH. 02. Dry up the slide. 03. Incubate the slide in denaturing buffer at 75°C for 3 min. 70% FA/2xSSC 04. Incubate the silide in ice-cold 70% EtOH for 3 min. 05. Transfer the slide in 100% EtOH for 3 min. 06. Dry up the slide. 07. put 4 ul of preincubated hybridization mixture onto the slide. 08. Cover the target area of the slide by the coverslip with probe. 09. Seal with rubber cement. 10.Hybridize at least O/N at 37C. Wash and mounting 01. After hybridization, carefully peel off rubber cement from slides. 02. Incubate the slides in 2xSSC/0.01% TritonX for 5-10 min at RT to slide off the coverslips. 03 Wash in 2xSSC at 45°C for 5 min x 2. 04. Wash in 0.2xSSC at 45°C for 5 min x2. 05. mount with vectorshild and detection

Re2 削除/引用 No.907-5 - 2011/09/12 (月) 20:34:51 - little >細胞はほとんど同調しません。細胞にもよりますけど15ｈくらい必要でしょう。 お返事ありがとうございます。 元のプロトコルは150 ng/ml 5hでした。(研究室の同調方法） そのときほとんどのCellが丸くならなかったため、 上の人の意見から越えてしまった可能性（鋭→丸→鋭）があると考え、濃度を上げ時間を短くしました。 次回は15ｈ程度で行ってみようと思います。 貴重な意見ありがとうございます。

Re 削除/引用 No.907-4 - 2011/09/12 (月) 20:23:40 - little 返信ありがとうございます。 BACというのは、Bacterial Artificial Chromosomeのことでしょうか？ 初めて聞いたので調べていますが、p53遺伝子座を導入したBACをテンプレートにするということですか？無知ですいません。 プロトコルの最初は回収後、遠心、10×PBS、遠心、75 mMKCl,遠心後カルノアです。HCl処理もしくはPK処理をするとなると低張液処理の前ですか？ カルノア処理後の90℃はやめて37℃o/nの方法を取ろうと思います。 しかし、なぜカルノア後の90℃乾燥が良くないのでしょうか、もし宜しければ教えて下さい。

(無題) 削除/引用 No.907-3 - 2011/09/12 (月) 02:35:21 - 細胞にもよりますけど FISHの知識は私はありませんが、 ＞ノコダゾールで200 ng/ml3時間同調したあと、 では、細胞はほとんど同調しません。細胞にもよりますけど15ｈくらい必要でしょう。

ga@gaga.ga 削除/引用 No.907-2 - 2011/09/12 (月) 01:52:26 - FISH プローブ用のテンプレートDNAにはBACを使いなさい。 プロトコルに不自然な点がいくつかあります。HCl処理かPK処理をした方がいいでしょう。 また、カルノア後の90°C乾燥はやめなさい。

FISH(fluorescence in situ hybridization)トラブル 削除/引用 No.907-1 - 2011/09/11 (日) 23:43:27 - little 現在私の研究室では、FISHを用いてM期に同調したMEFを使用してがん抑制遺伝子（p５３）locusを観察しようとしているのですが、数個の細胞のみしか特異的にスポットに染色されません。当研究室では、FISHに関して専門性をもった人は居ないため、FISH操作に詳しい人に意見を伺いたく質問します。 私は、卒研生であるので少し言葉足らずかもしれません。お許しください。 問題点：FISH後、観察すると核全体が蛍光でそまり（DAPIと重なる）、スポットとして検出されません。M期で同調しているため、二つの特異的スポットが出てくると予想しています｛なぜなら,特定のrepairたんぱく質を落として（mash2-/-はdiploidyであることが観察されたからです）｝ 一つのスポットだけ見られることも多いです。また、核から少しずれたところにスポットが見られることもあります。 FISHのプロトコルは、ネット上のプロトコルとほぼ同様です。 ノコダゾールで200 ng/ml3時間同調したあと、回収し、carnoy溶液に溶かし、20 μlスライドに滴下します。 90℃で一時間半乾燥後、8％パラホォルムアルデヒド/PBS、10×PBS、エタノール(氷冷70％、80％、100％）に五分ずつつけます。 30分程度乾燥後 75℃で変性させたプローブを6μ〜10μl滴下します。(カバーガラス をし、ペーパーボンドで密閉します） 69℃でmeltさせ37℃インキュベーターでo/nします。 その後0.1×SSC（59℃）で三回washして DAPI染色します。 プローブは自作しました。 プローブは、MEFの不死化細胞をテンプレートとして三点プライマーを購入し、PCRで増幅した後、ウエスタンで特異的バンドを確認しキットで精製しました。 今度は精製したものをテンプレートとして、 PCRでプローブを作成しました。 私にはFISH結果の知識がほとんどないので、正直バックが高いのか、プローブの結合が悪いのかわかりません。 核全体が染まることはどのようなことが考えられるのでしょうか。 また、成功と思われる結果を探すのにかなりの時間を要しますが、 FISHでほとんどすべての細胞を特異的に染めることはできるのでしょうか？

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