BioTechnicalフォーラム [cDNAの塩基数について]

cDNAの塩基数について

No.90-TOPIC - 2011/03/02 (水) 14:21:54 - chito

はじめまして。よろしくお願いします。
研究初心者です。

先日、ある遺伝子をリアルタイムPCRしましたが、結果はきれいな増幅曲線を描きませんでした。
その後に先輩からアドバイスをもらい、増幅後のcDNAを電気泳動したところ、シングルバンドがはっきり観察されました。
この結果の解釈に困っています。

質問は、

①「PCR後のcDNAの塩基数」というのは「Amplicon」の塩基数の2倍と考えて良いのでしょうか？遺伝子の塩基数の調べ方を教えていただけるとうれしいです。

② リアルタイムPCRで増幅されなかったものが、電気泳動でシングルバンドとして観察される事があるでしょうか？

よろしくお願いします。
　

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No.90-6 - 2011/03/03 (木) 18:20:05 - chito

> cDNA：
> cDNAをRNAより逆転写して調製した相補的なDNAという意味で使っているのであれば、分解しない限りはPCR後にも塩基数は変わらないでしょう。
> cDNAをPCRの増幅産物のつもりで使っているのであれば、それはAmpliconそのものを意味しています。

「cDNA」は、後者のつもりで使っていました。
この場合、それがAmpliconそのものである事がわかりました。
ありがとうございます。

> >遺伝子の塩基数の調べ方
> クローニングして、シークエンシングすることで調べることができます。
> どこまでを遺伝子と考えているのかが分かりませんが、
> RACE法について調べると、何を知りたいのかが自覚できるようになると思います。

ありがとうございます。
RACE法について勉強します。

ご丁寧にありがとうございました。

(無題)

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No.90-5 - 2011/03/03 (木) 12:41:41 - chito

「ami3」さん、「へっぽこ」さん、ありがとうございました。

他のサンプルを使って、蛍光試薬と機械の設定を確認してみます。

勉強します。

(無題)

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No.90-4 - 2011/03/03 (木) 10:57:33 - ~

①
言葉の定義の問題でしょう。
cDNA：
cDNAをRNAより逆転写して調製した相補的なDNAという意味で使っているのであれば、分解しない限りはPCR後にも塩基数は変わらないでしょう。
cDNAをPCRの増幅産物のつもりで使っているのであれば、それはAmpliconそのものを意味しています。

Amplicon：
「PCR後のcDNAの塩基数」を前項の前者の意味で使っているのであれば、Ampliconとは無関係な数字になります。
後者の意味で使っているのであれば、
増幅産物の塩基数＝増幅産物の塩基数の2倍
は成立しないでしょう。

>遺伝子の塩基数の調べ方
クローニングして、シークエンシングすることで調べることができます。
どこまでを遺伝子と考えているのかが分かりませんが、
RACE法について調べると、何を知りたいのかが自覚できるようになると思います。

(無題)

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No.90-3 - 2011/03/02 (水) 21:00:31 - へっぽこ

①の質問の意図はわかりかねますが、②についてはReal-time PCR
で発現が観察されなかったサンプルを泳動した所、本来ならばバン
ドがないはずだがシングルバンドが得られたという事でしょうか。

必ず発現の観察されるサンプル（またはポジコン）についても検出
がされないのであれば、以下の可能性が十分考えられると思います。

1, 蛍光試薬がへたっている
2, 機器の設定ミス

1, 2の場合ですと、増幅はされるが蛍光は発しない、または検出で
きないという事になると考えられます。
同じ試薬を使ったほかの人の結果を見せてもらう、機器の設定を再
チェックするといった事をまずしてみるとよいと思います。

何の遺伝子を用いているかわかりませんが、塩基数といった情報は
NCBI等のデータベースから簡単に検索する事が出来ます。

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/guide/

とりあえず

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No.90-2 - 2011/03/02 (水) 19:57:15 - ami3

質問は何を言っているのかさっぱりわからないので、先輩に全部聞いてください。お願いします。

cDNAの塩基数について

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No.90-1 - 2011/03/02 (水) 14:21:54 - chito

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