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(無題) 削除/引用 No.896-12 - 2011/09/14 (水) 21:03:55 - Harmonia 一まとめの言い方として、このベクターはとか、この宿主は、とかいうことはできると思います。が、発現用の宿主にベクターを入れて、コロニーを拾って見ると、仰るような漏れがあるものや漏れの少ないものなど、様々出てきたことがありました。 菌の１匹１匹に個性が現れたと思いました。 それで、誘導の明確なコロニーを抗生物質無しで培養して、導入したプラスミドを抜いて、宿主を分離したことがあります。 評判のいい宿主を企業から買うのも一つの方法。 僕みたいに、手持ちから拾い上げるのも一つの方法。

(無題) 削除/引用 No.896-11 - 2011/09/11 (日) 03:26:30 - ab NovagenのpETシステムのマニュアルに、どうしてグルコースを入れると基底発現を抑えられるか書いてます。ちょっとわかりずらいですが。あと濃度も。 ご参考までに。

(無題) 削除/引用 No.896-10 - 2011/09/10 (土) 15:39:42 - sharp abさん 培地はLBを使っています。たしかグルコースを入れるとリークが抑えられると聞いたことがある気がしますが、実際に確認したことは無いです。一度やってみます！ありがとうございます。

(無題) 削除/引用 No.896-9 - 2011/09/10 (土) 06:36:23 - ab 培地は何を使ってますか？ グルコースは入ってますか？

(無題) 削除/引用 No.896-8 - 2011/09/09 (金) 22:21:42 - sharp さくさん ありがとうございます。 メーカーではかなり制御できているようなことが書かれていますが、だだ漏れということもあるんですね。 今回の経験からするとタンパク質、もしくは大きさによるんでしょうか？ モモさん ありがとうございます。宿主にもよるんですか。。。？これもメーカーによると、より厳密に制御できると書かれているのですが、わからないものですね。もっと厳密に制御できる宿主をご存知でしたら教えて下さい。 IPTGなしで誘導できるのは嬉しいのですが、IPTGでON/OFFできないのはなんだか気持ち悪くって・・・

(無題) 削除/引用 No.896-7 - 2011/09/09 (金) 19:26:01 - モモ その宿主なら私も使ったことありますが、そのときはリーキーでした。 高価なIPTGを使わなくても目的のものが発現しているのなら、ラッキーですよね。CBBでも見れるくらい発現しているんですよね？CBBで見れないなら大したリークではないと思います。

(無題) 削除/引用 No.896-6 - 2011/09/09 (金) 19:11:06 - さく お使いのsigmaのは使ったことはありませんが、T7lacで同様に、IPTG無しでも発現がだだ漏れで、IPTGを入れてもほとんど変わらなかったことはあります。発現させるタンパク質に依るのかなぁと思っていました。 メーカー的にはリークが少ないと言うけれど一概にそういうものではないのかなと思ったのでそういう事があったことは覚えているのですが、サイズなどは覚えていません。

(無題) 削除/引用 No.896-5 - 2011/09/09 (金) 17:00:30 - sharp ~さん 発現チェック用のタンパク質は、リゾチームで大腸菌を溶菌後、念のためソニケートをかけ、遠心分離後上清は可溶画分として、沈殿は少量のバッファーを加え懸濁した後不溶画分として泳動にかけております。 不思議なことに？小さなタンパク質はほぼ全て不溶画分に、大きい方は可溶画分にシグナルがあります。 確かに大きなタンパク質の場合、可溶画分のバンドの濃さはほぼ同じで不溶画分にはIPTG有りの方にうっすらとバンドが見えていますが、それにしてもIPTG無しのバンドが濃すぎるように思うのですが。。。

(無題) 削除/引用 No.896-4 - 2011/09/09 (金) 09:14:42 - ~ 検出感度が十分高ければ、多少のリークはしているものだと思いますが。 WBはタンパク質4種類を同時に1枚のメンブレンで見ているのでしょうか。 大きいタンパク質→誘導はされているが、inclusion bodyにいっていて、上清に来る分はリーク時と同じ はありうると思いますが、発現チェック用のタンパク質はどう調整しているのでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.896-3 - 2011/09/09 (金) 07:32:40 - sharp 宿主はプロメガのBL21(DE3)pLysSを用いております。この株に問題があるのでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.896-2 - 2011/09/09 (金) 07:04:29 - モモ プロモーターより宿主のほうが気になるなぁ・・・

T7プロモーターはLeaky？ 削除/引用 No.896-1 - 2011/09/08 (木) 23:57:28 - sharp SigmaのpT7-MAT-Tag-FLAG-2ベクターを使用して組換えタンパク質を作製しています。 このベクターのプロモーターであるT7プロモーターのLeakについて教えて下さい。 4種類のタンパク質をこのベクターで作製しており、2つは約３５ｋD、あとの2つは約５０ｋDが予想サイズです。 発現誘導チェックをウェスタンブロット（抗FLAG抗体）を行ったところ、分子量の小さい2つのタンパク質はIPTGありと無しできれいに誘導に差が見られました。しかし大きい2つでは、IPTGありにも無しにも予想サイズのバンドがみられ、両者で濃度の差がほとんどみられませんでした。ただ、このバンドは小さいタンパク質を発現するクローンには見られないものなので、非特異反応では無いように思います。 T7プロモーターはインサートのサイズが大きくなるほどLeakyになるというようなことがあるのでしょうか？ 正直Leak自体は大きな問題はないのですが、IPTGにより産生が増加したいというのが気になります。 誘導は37度で行っており、IPTGは0.5mMで3時間の前培養後、3時間誘導を行いました。 ご助言、ご意見いただけますと幸いです。 よろしくお願い致します。

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