BioTechnicalフォーラム [マウス骨髄由来樹状細胞の培養]

マウス骨髄由来樹状細胞の培養

No.886-TOPIC - 2011/09/07 (水) 14:39:59 - トマト

最近, マウス(B6)骨髄由来樹状細胞(BMDC)の培養を始めたのですが上手く分化ができていない気がするので教えてください.

手順は赤血球除去→3回洗浄→BM細胞を25ng/mL GM-CSFを含んだ培地で3日間培養→培地交換し, 4日間培養して実験に使っています.

気になる点は培養7日後になってもほとんどの細胞がしっかり接着していること, CD11c陽性細胞が約30%と少ないことです. ノントリートメントのウェルを使用しても接着してしまいます. だいたい分化終了後には何%くらいの細胞がCD11c陽性になるのが一般的なのでしょうか. 分かりにくい説明かもしれませんがご教授宜しくお願いします.
　

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No.886-9 - 2011/09/13 (火) 12:26:05 - あ

Miltenyiは使ったことがありません。。
R&Dかpeptrotechを5-10ng/mLで今のところうまく行っています。

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No.886-8 - 2011/09/13 (火) 11:05:03 - トマト

> あさん
> GM-CSFの由来はどこですか？

ミルテニーのGM-CSFを使用しています。リサーチグレードとプレミアムグレードがあるのですが、リサーチグレードを使用しています。

(無題)

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No.886-7 - 2011/09/13 (火) 07:59:19 - あ

赤血球を殺した後、ウサギコンプリメントと分化マーカー抗体を加えて、分化した細胞を除いています。ずっとその方法でコンプリメントを抜かしたことがなく、どれくらい効果があるのかは実は知りません。。。

ラボでBMDC prepがうまく行かなくなったことがあって、IL-4を加えていた人もいますが、原因が不明のままいつの間にか解決して、結局IL-4無しでやってます。

1匹からbone marrow stem cellsが30-40millionくらい、1週間後に、ほぼ同数のCD11c+細胞が得られます。

GM-CSFの由来はどこですか？

(無題)

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No.886-6 - 2011/09/09 (金) 17:18:37 - トマト

> あさん
> 5日ー7日くらいで8割以上はCD11c+になりますよ。
> ウエルの底に付着した細胞もたくさんいますが、その上に付着していない
　細胞もたくさんいます。
　
8割以上ですか(汗)。ピペッティングでようやく剥がれてくれるので、ほとんどの細胞が他の系に分化してしまっているかもしれません。

> GM-CSFの由来や細胞密度かも。補体を使う方法を知っていますか？

C3aを使う方法でしょうか？ちらっと見た記憶がありますが、なるべく添加したくないかもです。C57BL/6由来のBM細胞なので、IL-4を添加するべきでしょうか？BALB/cに比べてIL-4産生が低いと思われるので。

(無題)

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No.886-5 - 2011/09/09 (金) 17:09:53 - トマト

>7744さん
>本題とは違うけど、GM-CSFは10ng/mlで十分ですよ。
ありがとうございます。次回はその濃度で試してみます。

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No.886-4 - 2011/09/09 (金) 15:53:07 - あ

5日ー7日くらいで8割以上はCD11c+になりますよ。
ウエルの底に付着した細胞もたくさんいますが、その上に付着していない細胞もたくさんいます。
GM-CSFの由来や細胞密度かも。補体を使う方法を知っていますか？

(無題)

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No.886-3 - 2011/09/08 (木) 12:31:07 - 0908

「3日間培養→培地交換し, 4日間培養」はよく書かれている方法で、以前この通りやって、後半の４日間培養で培養液がかなり黄色くなり、DCへの分化があまり良くなかった経験があります。その時は２日毎の培養液交換でうまくいきました。細胞の密度によるでしょうが・・・。