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ありがとうございます 削除/引用 No.88-15 - 2011/03/02 (水) 19:06:53 - 昆虫細胞 いろいろなご意見ありがとうございました。 SF9細胞は無血清に順化したものです（会社名はあえて書きませんが） 皆さんの回答から 融解温度を30度に変更 融解後、100g5分で遠心しDMSO入りの保存液を取り除く 以前よりも濃い細胞濃度で培養する 培地への血清添加 をやってみようと思います。 ありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.88-14 - 2011/03/02 (水) 18:29:42 - アザラシ Sf21細胞での話ですが・・・ バイアルから25cm^2フラスコ (培地量5 ml, FBS＋) に移した後、27℃で1〜3時間培養 (静置) し、付着したのを確認したら、培地交換しています。 他の方も指摘してますが、DMSOの昆虫細胞への影響は不明ですが、細胞によっては増殖や分化に影響するみたいです。 なので、付着が確認でき次第直ぐに培地交換すべきだと思います。

(無題) 削除/引用 No.88-13 - 2011/03/02 (水) 15:07:48 - ばいや すみません。 攪拌or回転で培養してたんですね。 攪拌の場合、細胞のダメージもあるので、解凍後いきなりその培養は止めたほうがいいと思います。 それと細胞は購入品でしょうか、自作でしょうか？ 自作ならそもそもそのロットが良い状態か確認されていますか？ それと他の人も書いていますが、凍結時に使用した試薬（DMSOとは限らないですが）は悪い影響を与えている可能性は高いです。

(無題) 削除/引用 No.88-12 - 2011/03/02 (水) 10:51:03 - ~ 買ってそのままその培地で起こそうとしているのですから、 http://toolsja.invitrogen.com/content/sfs/manuals/5004%20SF9%20&%2021%20cells%20in%20SF900III.pdf を買ったのですよね。 これ以外を買ったのであれば、根本的におかしな操作をしていると思います。 これを買ったのであれば、 37℃での融解や、いきなりの振盪培養は問題が無いはずです。 気になるのは、やはりDMSOの洗浄が書いていませんがおそらくはすべきかと思います。 また、蓋を閉めて酸欠にしてしまってはいませんよね。 その辺りに問題が無いことが確認できれば、 まずは輸入代理店に連絡して、対応策と代替品をどうするかについて相談してはいかがでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.88-11 - 2011/03/02 (水) 10:44:18 - DSC 下にも書かれていますが、Sf9は接着培養が基本なので、起こしてから接着状態で調子が出てきてからサスペンションに移行します。購入したものは初めから無血清でもOKなのですが、自前でフリーズストックしたものは起こしてしばらくは血清を加えていないと元気に増えません。私はSf900IIですが、起こしたときは5% FCSを加えておき、継代ごとに血清を1/2に減らして無血清に馴化させます（passage 5くらいで無血清に変えています）。その頃には接着が強く元気な細胞だけになっていますので、それをいきなりサスペンションに変更して大丈夫です。

(無題) 削除/引用 No.88-8 - 2011/03/02 (水) 09:54:12 - 非常に注意がいります。 その会社のプロトコールどおりにやるといいとおもいます。 この件はうまくいかないとハマるので非常に注意がいります。 私も付着条件で最初は培養します。なんとなくですが、Sf9は付着しているほうがハッピーです。 それから一部をとって浮遊条件で増やします。もうプレートに戻しても遅いかもしれませんが、試してみたらいいでしょう。

(無題) 削除/引用 No.88-7 - 2011/03/02 (水) 09:27:19 - ats SF900IIって、Sf9用の無血清培地ですよね。Sf9細胞は無血清培地に馴化されている細胞を購入したのでしょうか。そうでないとすると、通常のGrace培地+10% FBS・接着培養で元気よく増殖させてから、SF900IIに馴化させたほうが良いですよ。 また、ばいやさんが指摘しているように37℃ではなく30℃くらいで溶解させた方が失敗が少ないです。（heat-shock応答が起こるからでしょうか。） 今の細胞をresucueするには、遠心してコンフルエントの1/2ほどに濃縮後、血清を5%ほど添加、その後、1/4~1/2量植え継ぎのたびに血清を減らしていけば、良いかも？？？

(無題) 削除/引用 No.88-6 - 2011/03/02 (水) 09:17:49 - mAb sf9はsf900IIIに馴化されているものでしょうか？ こちらでやっているprotocolは以下の通りです。 １）凍結バイアル融解後、0.5%FBS/SF900IIIに3×10^6cells/mL程度で蒔き込む ２）2〜3日後あたりで倍量に増殖したら、1×10^6cells/mLに希釈 初期濃度を高めてやることと、初期のみFBSを入れてやると立ち上がりが早いです。 これでもダメな場合は静置培養に切り替えます。

(無題) 削除/引用 No.88-5 - 2011/03/02 (水) 09:16:16 - ~ 溶かすだけならば37度でも問題ないと思いますけどね。 溶けるまでに2分かかったのか、溶けても2分間温浴したのかがよく分かりませんが。 また、無血清培地であれば浮遊状態で飼うことが前提でしょうから、貼り付くことはないかと思います。 一番の問題は、その細胞は凍結前にどの培地にアダプトしていたのでしょうか？ もし、血清入り培地にアダプトされていたのであれば、いきなり無血清培地に入れても増えてこないかもしれません。 豪華な暮らしをしていたのに、いきなり貧しい暮らしには耐えられません。 次に、その細胞はどのように保存され、"ざっと"ではなく本当はどのように起こされたのでしょうか？ もしDMSO等に入っていて、１、２のステップが書かれている通りに行なわれているのであれば、 DMSOが洗い除かれていないため、DMSO等のダメージで死んでいるかもしれません。 毒と一緒には生活できません。

(無題) 削除/引用 No.88-4 - 2011/03/02 (水) 09:07:00 - ばいや 37度で解凍は温度が高いのでは？ 30度を超えるとよくないですよ。 それと毎日細胞をカウントって同じ細胞を毎回剥がしたりしているんですか？ もしそうだとしたら細胞にダメージを与えるし、大丈夫でも一旦剥がしてしまうと細胞増殖時の速度は遅いので増えるまで待つといいです。

(無題) 削除/引用 No.88-3 - 2011/03/01 (火) 22:13:58 - qq 培養条件に依存するのかもしれませんが、SF９は付着条件で培養していました。（10年前の事） 培地は、TC100＋Tryptose phosphate broth + 10%FCS で、CO2不添加で培養しました。 SF900で無血清培養する時は（やったこと無いのですが）、元気に増殖する細胞を徐々に順化させるのだと思いますね。

最初は 削除/引用 No.88-2 - 2011/03/01 (火) 20:32:55 - ami2 血清入れるんじゃなかったでしたっけ・・・

Sｆ9細胞について 削除/引用 No.88-1 - 2011/03/01 (火) 20:22:08 - 昆虫細胞 Sf9細胞を購入して培養しましたがうまく増殖しませんでした。 何かいい方法があったら教えてください。 ざっとプロトコールを書きます。 １．凍結チューブを37℃のウォーターバスで溶解する（2分以内） ２．125mlフラスコにあらかじめ27℃に暖めておいたSF900�Vを28.5ml 　　入れておく。凍結チューブ内容をフラスコへ移す。 ３．遮光条件、27.5℃、120rpmで培養する。 毎日細胞をカウントしましたが微増するだけで、生細胞率は70％前後でした。 よろしくお願いします。

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