全11件 ( 1 〜 11 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

(無題) 削除/引用 No.870-11 - 2011/09/05 (月) 00:18:21 - ウエスタンの評価 ウエスタンでうまくいっているかどうかは、他の手法（この場合はELISA)でうまくいっているかは、ふつうはそれほど指標にならないかと思います。ウエスタンとIPという２つの手法の関係ではほぼ常識に近いと思います。（理由はすでに指摘されています） １）ウエスタンでの評価は、まず、そのバンドのみがあるサンプルにおいてほぼ予想される位置にでるか？です。非特異のバンドがあってもいいのですが、ほとんどないのが理想です。 ２）さらに、その対象を含まないサンプル（ミュータント細胞、siRNA）でそのバンドが消失する。 ３）抗体に対する抗原ペプチドでそのバンドが消失する。 ウエスタンの評価としては、１のみか（ちょっと心配）、１と３（まあ安心）、１と２でほぼ完璧という感じでしょう。シグナルが強く、シングルバンド、予想される位置にでるのなら、１のみで私はオーケーとしますが、意見は分かれるでしょう。

(無題) 削除/引用 No.870-10 - 2011/09/04 (日) 16:10:45 - yuma qqさん、ABZOさん 色々とコメントありがとうございました。 指摘頂いたことを、これからやってみたり、問い合わせしてみようと思います。 また、結果がでましたら報告させて頂きます。

(無題) 削除/引用 No.870-9 - 2011/09/04 (日) 08:55:43 - ABZO 競合実験はどうよ。１次抗体の反応時にそのスタンダードを混ぜてやってみて、見えているシグナルが消えたら一応それか、構造的にそれに非常に近いやつ、と考えられる。消えなかったら（からといって即失望することはないけど）もしかしたらこれは違うものみてたかもしれないと。 そのスタンダードが実はヤバい可能性もあるから、それにあんまり固執しないで、早々に別のもの入手するとか自分でリコンビナント作るとかしてやった方が早いかも。

(無題) 削除/引用 No.870-8 - 2011/09/03 (土) 21:54:37 - qq サンプルのウェスタンで見えているシグナルと標準サンプルの分子量を比較するのですね。了解しました。 240ng/mlの標準タンパクは、そのままだと、吸着で不安定そうです。何らかのキャリア（たんぱく質）を添加してある可能性が、ありそうですが、如何がでしょうか？ CBBでは無理だとしても、銀染色や、蛍光染色で抗原タンパクを確認できると良いのですが、まあ、やってみないと判らないですね。 ELISAのメーカーにウェスタンの可能性について無理やり聞いてみるのもやってみるべきです。海外のメーカーでも、直接メールすると意外に応答があるかもしれませんよ。 2ng程度のタンパクは、ウェスタンで検出されるうえで少なすぎるとは思いませんが、抗体次第だとおもいます。個人的には、ELISAのほうがより弱いアフィニティーの抗体でも検出しやすいと、感じています。例えば、2ngのアクチンは、アクチン抗体で検出できないかもしれません。 話は少しそれますが、標準サンプルのリコンビナントたんぱく質にタグがついている可能性も考慮にいれるべきかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.870-7 - 2011/09/03 (土) 18:26:11 - yuma ABZO さんへ >ELISAで使ってるというスタンダードってfull lengthですか。もしかして、部分ペプチドとかそういうのではないでしょうか。もしそうならばSDS-PAGEでは小さすぎてみれないですね。 一応、そこは確認しているのですが、アミノ酸数で750ぐらいのものです。

(無題) 削除/引用 No.870-6 - 2011/09/03 (土) 17:24:22 - yuma 色々とご説明ありがとうございます。 >PVDF膜をある分子量のところで切断して、一方は、CBB染色して、もう一方は、イムノブロットすると言うことですか？ 説明不足で申し訳ありません。 コントロールのレーンとサンプルのレーンを切断して、コントロールをCBB染色、サンプルをイムノブロットと言う意味です。 抗体が認識しないのであってもPVDF膜に蛋白自体が転写されているならば、CBB染色（もしくは銀染色）で認められるバンドとサンプルのイムノブロットで認められるバンドが同じ分子量で認められるのかと思ったのでが・・・・ もしかして、これもまた意味不明な質問でしょうか？ ＞標準サンプルの量が少なすぎるとか、2ng/lane位でしょうか? そうですね。そのくらいになります。 ECL−primeのような化学発光の検出系だとできると思ったのですが・・・

(無題) 削除/引用 No.870-5 - 2011/09/03 (土) 17:17:50 - ABZO ELISAで使ってるというスタンダードってfull lengthですか。もしかして、部分ペプチドとかそういうのではないでしょうか。もしそうならばSDS-PAGEでは小さすぎてみれないですね。

(無題) 削除/引用 No.870-4 - 2011/09/03 (土) 16:43:11 - qq ＞と、いうことはサンプルは変性していないが、陽性コントロールとして使用したス＞タンダードのみが変性して認識しないと言うことでよろしいのでしょうか？ まあ、そんな都合のいいことはありそうもないので、別の可能性を考える方がよろしいですね。 １）標準サンプルの量が少なすぎるとか、2ng/lane位でしょうか? ２）悪い方の可能性は、”サンプルのバンドが非特異。”＋”この抗体はウェスタンで使えない”でしょうか。 ＞この場合、ブロッティングしたPVDF膜をコントロール部分だけ切って、蛋白染色し＞て、サンプルの方は抗体と反応させて、後で両者を合わせて比較するということは＞可能なのでしょうか？ 「この場合」が、どこに掛かっているのか判らないので、その後からですが、PVDF膜をある分子量のところで切断して、一方は、CBB染色して、もう一方は、イムノブロットすると言うことですか？ よくやられていることですが、質問の意図が見えません。”両者を合わせて比較する”内容次第ではないでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.870-3 - 2011/09/03 (土) 16:20:46 - yuma アドバイスありがとうございます。 ＞SDS-PAGEでタンパクが変性しているので、ウェスタンで使えない抗体は、＞変性した抗原を認識しないんだよねと、考えることが多いです。 と、いうことはサンプルは変性していないが、陽性コントロールとして使用したスタンダードのみが変性して認識しないと言うことでよろしいのでしょうか？ この場合、ブロッティングしたPVDF膜をコントロール部分だけ切って、蛋白染色して、サンプルの方は抗体と反応させて、後で両者を合わせて比較するということは可能なのでしょうか？ アドバイス頂けますと助かります。 宜しくお願い致します。

(無題) 削除/引用 No.870-2 - 2011/09/03 (土) 12:56:36 - qq まず、 �AELISAと同じ抗体を使用しているのにどうしてウエスタンで検出できないのか？ SDS-PAGEでタンパクが変性しているので、ウェスタンで使えない抗体は、変性した抗原を認識しないんだよねと、考えることが多いです。 �@そもそもELISAのスタンダードを用いることは間違いなのか？ 逆はあるよね。ウェスタン用の抗体を取ってくるときに、ELISAで抗体価を確認する。 ダメモトなら、やってみても良いのではなかろうかと思いますが、絶対安心ではないですよね。

ウエスタンの陽性コントロール 削除/引用 No.870-1 - 2011/09/03 (土) 11:28:37 - yuma はじめて質問させて頂きます。 素人でおかしな質問かもしれませんが宜しくお願いします。 ＥＬＩＳＡのキットで使用されているスタンダードをSDS-PAGE、ウエスタンブロッティングの陽性コントロールに使用しているのですが、何もバンドが出てきません（還元、非還元条件のどちらとも）。 同条件でサンプルにはバンドが認められるのですが、陽性コントロールにバンドが認められないものですから、サンプルのバンドも非特異なのか心配です。 スタンダードはリコンビナント蛋白で濃度的には240ng/mlあります。 ウエスタンで使用している抗体はELISAで使用されているものと同じもので、ウエスタン条件（ECL prime、5%スキムミルク使用)に合わせて使用しています。 教えて頂きたいことは、下記の２点であります。 �@そもそもELISAのスタンダードを用いることは間違いなのか？ �AELISAと同じ抗体を使用しているのにどうしてウエスタンで検出できないのか？ 宜しくお願い申し上げます。

全11件 ( 1 〜 11 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

パスワードを入力してチェックした記事を

チェックした記事を

このトピックにメッセージを投稿する 名前  メール  　アドレス非公開    タイトル  本文       設定  クッキーを保存（次回の入力の手間を省けます） 上に上げない（トピックの一覧で一番上に移動させません） 解決（問題が解決した際にチェックしてください） 暗証  半角英数字8-12文字の暗証番号を入れると、あとで削除、修正ができます。 送信

---

〔使い方〕 「アドレス非公開」をチェックすれば、自分のメールアドレスを公開しないで他の方からメールを受け取れます。 問題が解決した際には、解決ボタンをチェックして解決した旨のコメントをつけてください。これは、初めにトピックを作った人と管理人のみが可能です。 半角カタカナ、機種依存文字(全角ローマ数字、○の中の数字等)は文字化けの原因となりますので使わないでください。

---