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(無題) 削除/引用 No.860-4 - 2011/09/01 (木) 21:00:54 - AP もう指摘がありますが、サイクル過剰、鋳型過剰のときに起こるPCR産物の重合によるスメアだと思います。 鋳型過剰、あるいはPCRサイクルが過剰になると、鋳型になるべきDNA鎖の3'末端が別のDNA鎖に不正にアニールして伸長が起こり長くなった産物ができてきます。サイクルが増えるごとにいろいろな長さ、いろいろな構造に重合した産物ができスメア状になります。

(無題) 削除/引用 No.860-3 - 2011/09/01 (木) 13:25:25 - ~ 1st PCRからどのくらいのPCR産物持ち込んだのですか？ それが、2^30倍にきれいに増えるような条件なのですか？ 仮に、1st PCR産物の目的のバンドが50ng/uLの濃度で、1/50倍に希釈して1uLを2nd PCRに持ち込んだとすると、バイアルあたり1ngを持ち込んだことになります。 それが全て順調に増えれば、10^9ng = 1gの2nd PCR産物が出来る計算になります。 そこまで増えるようなdNTPsやプライマーを入れてはいないと思いますし、 その様なDNA濃度が濃い条件では非特異なDNA結合がおき、目的のサイズのバンドのみを得るというのは難しいでしょう。 簡単に言うと、2nd PCRを回しすぎたか、1st PCRからの持込が多すぎるのでは。

(無題) 削除/引用 No.860-2 - 2011/09/01 (木) 13:15:28 - ats 50倍希釈で30サイクル、というのが問題だと思います。残存primerも影響するでしょう。 primerを除く作業を行う、希釈率を上げる、もしくは10~15サイクルに減らしてはいかがでしょうか。

nested PCR 削除/引用 No.860-1 - 2011/09/01 (木) 12:39:51 - fire 一回目のPCRでは目的の遺伝子だけでなく多数のバンドが増えてきていたので、 nested PCRを試みました。 一回目のPCR産物を1/50希釈して、内部のプライマーを用いて30サイクルのPCRを行いました。 その結果、スメアになってしまい、目的の断片も増幅されていませんでした。 ２回目のプライマーセットでは目的の断片は増えるのですが、 nested PCRにしたとたん全く増えなくなるといったことはどういう原因が考えられるでしょうか？

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