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10ulでも大丈夫 削除/引用 No.859-6 - 2011/09/10 (土) 13:05:47 - わ Biolad-C1000のreal time PCRはtotal volume 10ulで、きっちりきれいなdataがでています。メーカー側からも10ulで大丈夫と言われました。

(無題) 削除/引用 No.859-5 - 2011/09/08 (木) 22:36:32 - 般若 コメントありがとうございます。 やはりtotal volumeはこれ以上減らさないほうが良さそうですかね・・・。 マイナーなブランドの安価なキットを使っているのですが、つい欲（？）が出てしまいました。 EvaGreenをチェックしてみましたが、うまくいけばかなり経済的ですね。セットアップをいかに効率的にやるかが鍵でしょうか。 差し支えなければ相性の良いPCR酵素を教えていただけないでしょうか？

オリジナル 削除/引用 No.859-4 - 2011/09/08 (木) 12:59:15 - Hiro わたしはsyber greenのレディーメイドマスターミックスではなく、ホットスタートのPCR酵素＋EvaGreen dyeで自作マスターミックスをつくってリアルタイムPCRを行っています。 ホットスタートPCR酵素でも、最初のactivationに必要な加熱時間が短いもので、伸長速度が速いものを使えば、1時間以内で45cycleまわして、meltも取るまで行えます。 酵素量・dNTP・dyeをけちれば、価格をけっこう安上がりに抑えられます。 （ざっと、大手のマスターミックスの1/3ぐらい） ただ、PCR酵素やPCR条件を替えるのをいやがるPIもいますし、条件出しでお金と時間がかかると本末転倒ですので... 参考になれば幸いです。

wellの大きさ 削除/引用 No.859-3 - 2011/09/06 (火) 17:47:01 - ema 96穴で0.2ml volumeだと20ul,0.1ml volumeだと12.5ulきると微妙な蒸散と底面液のカーブが高くなる影響して測定値が微妙な気がして、節約するにはここまでの減らしで止めてます。 クリティカル、微量な遺伝子には戻して元々の液量でします。

(無題) 削除/引用 No.859-2 - 2011/09/06 (火) 17:33:47 - わかめ サーマルサイクラー、試薬ともに　takaraを使用してます。 primer 11.5uL cDNA 1.0uL SYBER 12.5uL で、いつもやってます。 たぶんメーカーの推奨どおりだったと思います。 贅沢ですよね・・・。 でもtotal volme減らしてしたことがないです。

リアルタイムRT-PCRのSYBR green節約法 削除/引用 No.859-1 - 2011/09/01 (木) 11:58:28 - 般若 96-well-plate式のリアルタイムRT-PCRを持っています。SYBR greenは安くありませんので節約できればと考えています。 マシンのマニュアル上は25ul/wellのリアクションボリュームです。SYBR greenは2xのものを使っています。 SYBR 7.5uL その他 4.5uL テンプレート(cDNA) 3uL　（マルチピペットでアプライ） まで減らし、ハウスキーピング遺伝子(36B4)ならCt値18-19くらいで立ち上がります。 多くの方がリアクションボリュームを減らしていると想像しますが、皆様SYBRやcDNAの量など、どのようにアレンジされていますでしょうか？　今後の参考のために教えて頂ければありがたいです。

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