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タンパク修飾？ トピック削除
No.851-TOPIC - 2011/08/31 (水) 15:19:15 - lucid
いつも参考にさせていただいています。
現在、枯草菌にあるタンパクを分泌させ、その分泌タンパクを含んだ培養液を硫安沈殿し、精製して行く予定です。
本来、そのタンパクは、12kDaですが、硫安沈殿後のサンプルをウエスタンで確認したところ、28kDa周囲にバンドを認めます。タグはつけていません。還元剤の有無でバンドに変化を認めません。
枯草菌の分泌タンパクにおいて、例えば糖鎖付加等により、分子量が大きくなるようなことがあるのでしょうか。
ご教授よろしくお願いします。
　
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(無題) 削除/引用
No.851-7 - 2011/09/05 (月) 19:39:29 - ンンノ
２８ｋDaが目的タンパクだと思った理由が一つも書いてないですね。

(無題) 削除/引用
No.851-6 - 2011/09/04 (日) 16:33:47 - ABZO
とりあえず、その28Kを切り出して、トリプシンかなんかで断片化してマスとかで同定してみればすぐ決着つくな。目指すものだったら予想外の新展開も期待出来るかもしれない。LC/MS/MSとかで詳細に解析すれば同時に修飾に関する情報も得られるかもしれない。これはそっち系の専門家に頼んだ方がいいけどね。あとね、SDS-PAGEでは、理論値どうりの分子量にならないことはときどきにあるよ。ほんとかよ??ってくらいズレる事もある。修飾もそうだし、アミノ酸組成のかたよりとか、非共有結合でもSDS耐性の非常に強固なやつとかもたまにあるし、いろいろな理由で。

(無題) 削除/引用
No.851-5 - 2011/09/01 (木) 14:08:52 - Q
>それは、アミノ酸配列より予測される分子量です。
今後、その予測される分子量より大きいバンドをターゲットとして、精製していってよいものかどうかと考え、質問させていただきました。

それに対しては、誰も答えを出せないと思います。
何らかの方法で確認しないと。

(無題) 削除/引用
No.851-4 - 2011/09/01 (木) 13:18:46 - ~
#2の最後のコメントが、（起きていると考えている）トラブルの原因候補の一つと思いますが、それに対する回答はないのでしょうか。
それを放置して、新しいコメントを待つのは効率が悪いと思いますが。

>精製していってよいものかどうかと考え
と考えているのでしたら、まずは
１．endoで発現しているものを粗精製して、同じSDS-PAGE上での移動度を比較する
２．WBで目的タンパク質を確認する。
３．MS等で目的タンパク質を確認する。
などでバンドが目的タンパク質であるかを確認してはいかがでしょうか。
精製を考えているのであれば、精製物が目的物であることを確認する手段を持っていますよね。

糖鎖等で修飾されている場合には精製しても目的を達成できないと言うのであれば、MS/MSで全配列を読むのが早くて確実かと思います。
（修飾される可能性が糖鎖のみと分かっていれば糖鎖解析をしてもいいのでしょうけれども、未知の修飾に対して決めうちで解析を行なうのは効率が悪いでしょう。）

(無題) 削除/引用
No.851-3 - 2011/09/01 (木) 11:05:19 - lucid
Q様

それは、アミノ酸配列より予測される分子量です。
今後、その予測される分子量より大きいバンドをターゲットとして、精製していってよいものかどうかと考え、質問させていただきました。

(無題) 削除/引用
No.851-2 - 2011/08/31 (水) 16:50:25 - Q
＞本来、そのタンパクは、12kDaですが、

何を根拠とした情報でしょうか？
ウエスタンするとそれくらいの分子量に検出されるということでしょうか？
cDNAやアミノ酸配列から推定される分子量でしょうか？

ご存知とは思いますが、SDS-PAGEはcDNAやアミノ酸配列から推定される分子量を
反映しない場合があります。

タンパク修飾？ 削除/引用
No.851-1 - 2011/08/31 (水) 15:19:15 - lucid
いつも参考にさせていただいています。
現在、枯草菌にあるタンパクを分泌させ、その分泌タンパクを含んだ培養液を硫安沈殿し、精製して行く予定です。
本来、そのタンパクは、12kDaですが、硫安沈殿後のサンプルをウエスタンで確認したところ、28kDa周囲にバンドを認めます。タグはつけていません。還元剤の有無でバンドに変化を認めません。
枯草菌の分泌タンパクにおいて、例えば糖鎖付加等により、分子量が大きくなるようなことがあるのでしょうか。
ご教授よろしくお願いします。
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