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(無題) 削除/引用 No.85-21 - 2011/03/02 (水) 19:05:50 - aaaa > ＫＯＤ.Ｂｕｆ　５ul > ｄＮＴＰｓ　２ul > ＰｒｉｍｅｒＲ　０．３ul > ＰｒｉｍｅｒＦ　０．３ul > ＫＯＤ　　　　　０．２ul > Ｈ２Ｏ　　　　　１．９ul > ＤＮＡ　　　　　０．３ul（５０ｎｇになるように調整） > となっています。 MgSO4も入ってないし、本当にこの条件だったらおかしいです。

(無題) 削除/引用 No.85-20 - 2011/03/02 (水) 19:01:48 - B > aaaa様 > bufferって×10ですよね？ すみません、書き忘れてました。bufferは×２です。

(無題) 削除/引用 No.85-19 - 2011/03/02 (水) 18:59:06 - aaaa bufferって×10ですよね？ total 10ulだとBuffer 1ulでは？ タイプミスであるといいのですが。

(無題) 削除/引用 No.85-18 - 2011/03/02 (水) 18:45:00 - B >Boston-Pullman様 おっしゃる通り複数のサンプル分のマスターミックスをを調整しています。 ge >ンンノ様 > ０．２ulの酵素液を正確に取れるとは思えないのですが、大丈夫でしょうか。 > １０倍希釈してから使うとかしてれば問題ないと思いますが。 複数のサンプル分で調整しているので、実際に取る酵素量は１ulとかです。 >すけーるあっぷ様 > 折角なので何を何ul何ng何Mでトータル10ulなのかを詳細に書いてみては？ ＫＯＤ.Ｂｕｆ　５ul ｄＮＴＰｓ　２ul ＰｒｉｍｅｒＲ　０．３ul ＰｒｉｍｅｒＦ　０．３ul ＫＯＤ　　　　　０．２ul Ｈ２Ｏ　　　　　１．９ul ＤＮＡ　　　　　０．３ul（５０ｎｇになるように調整） となっています。 > それとピペッティング操作の問題と勝手に仮定して、あまり実験に慣れていないようなので最初は25-50ulの系でやってみては？失敗すれば数倍試薬を無駄にすることになりますが、もう何回も失敗しているのであれば思い切って。それなら微量な酵素1ulにしても確認しやすいですし。 一回、３０ulの系も試したのですが、結果は変わらずでした。僕が使っているマウスのgenotypingは出ないのですが、まったく別の系統のマウスのgenotypingは出来るので、操作の問題だけではない気もするのですが…。 > 現時点で0.2ul取った時、ちゃんとチップの先に見えてますか？まさか0.2ulの酵素をP20で取ったりしてないですよね？ それはしてないです。Ｐ２を使っていて、吸ったものはちゃんと確認しています。

(無題) 削除/引用 No.85-17 - 2011/03/02 (水) 16:38:21 - Boston-Pullman genotyping のようなので、複数サンプル分のマスターミックスを調製されているのではないでしょうかね。

(無題) 削除/引用 No.85-16 - 2011/03/02 (水) 13:00:41 - ンンノ ０．２ulの酵素液を正確に取れるとは思えないのですが、大丈夫でしょうか。 １０倍希釈してから使うとかしてれば問題ないと思いますが。

(無題) 削除/引用 No.85-15 - 2011/03/02 (水) 12:24:19 - すけーるあっぷ 折角なので何を何ul何ng何Mでトータル10ulなのかを詳細に書いてみては？ それとピペッティング操作の問題と勝手に仮定して、あまり実験に慣れていないようなので最初は25-50ulの系でやってみては？失敗すれば数倍試薬を無駄にすることになりますが、もう何回も失敗しているのであれば思い切って。それなら微量な酵素1ulにしても確認しやすいですし。 現時点で0.2ul取った時、ちゃんとチップの先に見えてますか？まさか0.2ulの酵素をP20で取ったりしてないですよね？

(無題) 削除/引用 No.85-13 - 2011/03/02 (水) 11:42:22 - B >nana様 > 10ulの反応系で酵素（KOD）が2ulというのは多すぎるのではないですか？ > 2 U の間違いでしょうか。それでも多いように思いますが．．． 失礼ましした。０．２ulの間違いです。

(無題) 削除/引用 No.85-12 - 2011/03/02 (水) 11:11:52 - nana 10ulの反応系で酵素（KOD）が2ulというのは多すぎるのではないですか？ 2 U の間違いでしょうか。それでも多いように思いますが．．．

(無題) 削除/引用 No.85-11 - 2011/03/02 (水) 10:51:58 - B > in situ様 返信ありがとうございます。 > ちょっと原因かどうか分からないですが、後輩が前にサーマルサイクラーのふたをきつく閉めすぎてPCRがかからなかった事例があります。 サイクラーはＴａｋａｒａのを使っており、スライド式？の蓋なので、そこは問題ないかと思います。 > 電気泳動がおかしいという可能性が消せていないような気がしたので、一応指摘してみました。 今日、別の人から出るサンプルをもらって試す予定です。ゲル自体はテクニシャンの方が作っているものなので、問題があるとしたらローディングとかかなと考えています。ちなみに、１００Ｖ、１％アガロースゲルで絵移動しています。 >~様 返信ありがとうございます。すみません、情報をちゃんと出せていなくて。どこまで書くのかがちゃんとわかっていなかったです（そういうのも上手くいかない原因になりそうので、気をつけます） > 先輩が同じプログラムで出来ているのであれば、PCRチューブへ必要な試薬をいれ、サーマルサイクラーに載せる部分までが問題がある部分ということになるでしょう。 もう一度先輩に見せていただきます。先生が言うには、ちょっと何かがずれると出にくい条件でやっているのかもしれないと言われたので、もう少しサイクラーの方も考えてみます。 > ただ、酵素は何uL入れていますか？ > 酵素にはグリセロールが添加されていて粘性が高く、チップの内外にくっつきやすいです。 酵素は、１サンプルにつき２uL入れています（Ｔｏｔａｌ：１０uLの系です） チップの入れ方につきましては、以前に別の実験で注意されたので、ほんとに先しか液面につけておらず、外側に付いているということはないです（毎回確認しています） >ンンノ様 > とりあえずプレパレーションをオンアイスでやってみては。 すみません、書き忘れていましたが、オンアイスでやっています。 >AP様 > 同じ材料を使って同じ手順でやって、うまくいく人とうまくいかない人があるというとき、手際のスムーズさが関係しているのかも知れません。 > KODのような校正活性のある酵素の場合、プライマーと酵素が共存してからthermal cycleにかけるまでの時間がだらだら長いと、プライマーが3'から削れてしまいます。3'が削れると、プライミングの特性が下がって、非特異的な伸長が起こりえます。 サンプル数を少なくしているので、そこまでスピードに差はないのですが…。もう一度そこも注意してやってみます。ありがとうございます。

(無題) 削除/引用 No.85-10 - 2011/03/02 (水) 10:28:13 - in situ ちょっと原因かどうか分からないですが、後輩が前にサーマルサイクラーのふたをきつく閉めすぎてPCRがかからなかった事例があります。 パーキンエルマー（今はバイオラッド？）のサーマルサイクラーでふたを回してしめるタイプなら要注意です。 あと、うまくいった（バンドが出る）サンプルとうまくいかない（スメアになる）サンプルを同時に泳動はしていますか？ 電気泳動がおかしいという可能性が消せていないような気がしたので、一応指摘してみました。

(無題) 削除/引用 No.85-9 - 2011/03/02 (水) 09:28:56 - ~ >僕が、ＤＮＡ抽出したものも先輩にもやっていただき、上手くいっていました。 ゲノムDNA抽出に問題ないことが確認できているということです。 そのため、PCR部分に問題があることになりますね。 先輩が同じプログラムで出来ているのであれば、PCRチューブへ必要な試薬をいれ、サーマルサイクラーに載せる部分までが問題がある部分ということになるでしょう。 0サイクルの話は、貴方が中途半端な情報しか出さないために極端な例を書いただけで、 ゲノムDNA抽出に問題が無いことが確認できていますし、やる意味はないでしょう。 温度とサイクル数は見てもいいともいますが、先輩が同じ条件で再現よく出来ているのであれば、後回しにしてもいいでしょう。 先輩と隣で一緒にPCR部分をやれば、どの部分に違いがあるのかが見えてくると思います。 とりあえずは温度、時間、入れる量くらいしかパラメーターは無いと思います。 オンアイスと手際については既に書かれていますので、残るのは入れる量ですが、 先輩や教員が見ているのであれば、ピペットマンの目盛り自体を間違えていることはないでしょう。 ただ、酵素は何uL入れていますか？ 酵素にはグリセロールが添加されていて粘性が高く、チップの内外にくっつきやすいです。 もしかしたらチップを液面より深く差し込んで、外側にも付いたままPCRチューブに持ち込んでいたりしませんかね。

(無題) 削除/引用 No.85-8 - 2011/03/01 (火) 21:32:12 - ンンノ そうですねぇ 天才的に実験がうまい人から教わっても上手くいかないことがあります。 とりあえずプレパレーションをオンアイスでやってみては。

(無題) 削除/引用 No.85-7 - 2011/03/01 (火) 21:28:45 - AP 同じ材料を使って同じ手順でやって、うまくいく人とうまくいかない人があるというとき、手際のスムーズさが関係しているのかも知れません。 KODのような校正活性のある酵素の場合、プライマーと酵素が共存してからthermal cycleにかけるまでの時間がだらだら長いと、プライマーが3'から削れてしまいます。3'が削れると、プライミングの特性が下がって、非特異的な伸長が起こりえます。 校正活性のある酵素の場合、あらかじめ作った、鋳型・プライマー・dNTPの混合液と、酵素・バッファーの混合液を混ぜたら、即thermal cycleにかけるとよいです。

(無題) 削除/引用 No.85-5 - 2011/03/01 (火) 20:10:56 - B 皆様、返信ありがとうございます。 > ~様 ＞その先輩と貴方の操作の違いが原因と考えて間違いないでしょう。 ＞その違いがどこかを確認しましょう。 先生や先輩にも操作を見ていただき、かつ、見せていただき、一緒にもやってもらったのですが、結果は変わらずでした。 先輩には、既に何度か見せていただき、また、見てもらってもいるのですが、いまいち原因がわからない、とのことです。 ＞�@ゲノムDNA抽出（先輩・貴方） ＞ �APCR（先輩・貴方） ポジコンは、先輩がＤＮＡ抽出したものであり、先輩は出しています。また、僕が、ＤＮＡ抽出したものも先輩にもやっていただき、上手くいっていました。 > >アニーリング温度やサイクル数、伸張時間などもいじってみたのですが > どこまで検討したのでしょうか？ > 0サイクルでもスメアになっているのであれば、PCR部分の問題ではなくテンプレートが原因でしょう。 ０サイクルは試していませんでした。ポジコンがあるので、テンプレートには問題がないとばかり思っていました。試してみます。 > アニーリング温度を十分に上げれば特異的な増幅すらしなくなるでしょう。 ５５℃から６３℃では、結果は全部同じようなスメアの形でした。一回やるごとに、先生と先輩に相談しているので、次は６５℃以上を試してみます。 > >あるマウスのgenotypingを > ゲノムDNAの抽出は適切な方法でしょうか？テンプレートでいらないものを持ち込んでいれば、その先だけがんばってもリカバリーは難しいかもしれません。 先輩も僕もフェノクロ抽出・エタ沈で行っていて、最後に、ＴＥにといています。問題はないと思いますが……。 > ゲノムDNAの持ち込み量が多すぎませんか？多ければ、非特異増幅もおきやすいです。 ＤＮＡは濃度を測って、５０ｎｇになるようにしています。多いでしょうか？ > >�A〜�Cを３４サイクルでまわしております > 回しすぎて、PCR産物同士がミスアニーリングして、スメアになったのかもしれません。 ２８サイクルまで落としてやってもみたのですが、結果は一緒でした。> > 昔の話ではなく、現時点で酵素やdNTPsに問題が生じていないことをどのように示すことが出来ますか？ スメアばかりになっていたところに、先生から試薬が悪いのかどうか確かめる為に、別のＤＮＡ（プライマー違う）を使って、行ったところ上手くいったので、試薬はダメになってないと判断しました。 ＞ＴＳ様 返信ありがとうございます。 見てもらっていますし、一緒にもやっていただいたのですが……。先輩のも見せてもらい、さらに、先輩と僕のやり方を先生が見て比較もしてもらっています。なので、もしかしたら先生、先輩、僕の三人が全く思っていなかったところに原因があるのかもしれないと思い、お聞きした次第です。 ＞ami2様 返信ありがとうございます。 もちろん先輩は実験の師匠なので、何度も相談し、いろいろアドバイスをもらったり実際にやってもらったり、見ていただいたりもしています。 しかし、出なかったために（先輩にも原因が不明）、もしかしたら、思いもよらないところに原因があるのではと思い、お聞きした次第です。

(無題) 削除/引用 No.85-4 - 2011/02/28 (月) 21:03:22 - ami2 > 皆様、知恵をお貸しいただけないでしょうか？ 先輩の知恵を借りなさいょ…。

(無題) 削除/引用 No.85-3 - 2011/02/28 (月) 21:01:49 - TS 対策：先輩に見てもらう。いっしょにやる。

(無題) 削除/引用 No.85-2 - 2011/02/28 (月) 20:09:15 - ~ >現状、どうしようもない感じです。 何も手がかりがないのでしたら、問題が起きていないことを確認できる部分を増やし、問題がある部分を同定していくのがいいと思います。 ただ、貴方の場合はその様な解決法は勉強にはなっても、ラボの金を無駄に食うことになるかと思います。 >上手くいかない方のプライマーも先輩がやったところ上手くいっており 同じプライマーを使って先輩が出来ているのであれば、その先輩と貴方の操作の違いが原因と考えて間違いないでしょう。 その違いがどこかを確認しましょう。 簡単な原因の同定方法としては、その先輩に御願いして、 �@ゲノムDNA抽出（先輩・貴方） �APCR（先輩・貴方） で2x2のマトリクスを組んで実験し、貴方の操作のうち、ゲノムDNA抽出とPCRのどちらに問題があるかを切り分けるのが早いと思います。 おそらく今の実験内容であれば、問題が生じうるのはその2点ですよね。 >アニーリング温度やサイクル数、伸張時間などもいじってみたのですが どこまで検討したのでしょうか？ 0サイクルでもスメアになっているのであれば、PCR部分の問題ではなくテンプレートが原因でしょう。 アニーリング温度を十分に上げれば特異的な増幅すらしなくなるでしょう。（シャトルPCRでも増えるのかもしれませんが） 何を検討してどのような結果になったのかを伝えられないと、原因の追究のための情報提供にはなりません。 >あるマウスのgenotypingを ゲノムDNAの抽出は適切な方法でしょうか？テンプレートでいらないものを持ち込んでいれば、その先だけがんばってもリカバリーは難しいかもしれません。 ゲノムDNAの持ち込み量が多すぎませんか？多ければ、非特異増幅もおきやすいです。 >�A〜�Cを３４サイクルでまわしております 回しすぎて、PCR産物同士がミスアニーリングして、スメアになったのかもしれません。 サイクル数を減らす方向で検討してみてはいかがでしょうか。 >５５℃〜６３℃を試しています。 63℃でもスメアであれば、もっと上の温度も見てみてはいかがでしょうか。 >その時に使った、酵素（ＫＯＤ）バッファー、ｄＮＴＰｓを使っているので 昔の話ではなく、現時点で酵素やdNTPsに問題が生じていないことをどのように示すことが出来ますか？ それを示して初めて、試薬に問題が無いといえます。

ＰＣＲのスメア 削除/引用 No.85-1 - 2011/02/28 (月) 17:09:08 - B こんにちは。初めて書きこませていただきます。研究室に所属する学生です。 現在、あるマウスのgenotypingを行っているのですが、ＰＣＲで増幅後、産物を電気泳動したところ、１００％スメアになってしまい、目的のバンドが全く見られません。 アニーリング温度やサイクル数、伸張時間などもいじってみたのですが、効果は見られませんでした。現状、どうしようもない感じです。どのようなことが考えられるでしょうか？ ちなみに、 �@９４℃　２分 �A９８℃　１０秒 �B５９℃　３０秒 �C７２℃　１分 �A〜�Cを３４サイクルでまわしております。アニーリング温度は、５５℃〜６３℃を試しています。 上記とは異なるＤＮＡ、プライマーを使うＰＣＲはうまくいきました。その時に使った、酵素（ＫＯＤ）バッファー、ｄＮＴＰｓを使っているので試薬には問題はないと思います。また、上手くいかない方のプライマーも先輩がやったところ上手くいっており、問題はないかと思います。 ＤＮＡもポジコンとして一度出たのを使っています。 正直、どうすればいいかわかりません。 皆様、知恵をお貸しいただけないでしょうか？

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